《赛默飞&Gibco：细胞培养基础知识手册（132页）.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《赛默飞&Gibco：细胞培养基础知识手册（132页）.pdf（132页珍藏版）》请在三个皮匠报告上搜索。

1、细胞培养基础知识手册掌握基本的细胞培养技术，取得一致的实验结果携手共进本文档中的信息如有更改，恕不另行通知。免责声明THERMO FISHER SCIENTIFIC和/或其附属公司不对本文档提供任何明示或暗示的保证，包括但不限于适销性、特定用途适用性或非侵权性的保证。在任何情况下，无论是否以合同、侵权、担保，抑或任何法规为依据，或以任何其他特殊依据为基础，对与本文档有关或因本文档引起的（包括但不限于对本文件的使用）特殊、偶然、间接、惩罚性、多重或后果性的损害，在法律允许范围内，LIFE TECHNOLOGIES和/或其附属公司均不承担责任。2020 Thermo Fisher Scientif

2、c Inc.保留所有权利。COL011985 0820目录细胞培养基础知识|iii仅供教学使用。1.引言 .1手册目的 .1细胞培养简介 .2什么是细胞培养？.2有限细胞系与连续细胞系.2培养条件.2冷冻保存.3培养细胞的形态.3细胞培养的应用.32.细胞培养实验室 .4安全 .4生物安全等级.4SDS.5安全设备.5个人防护装备（PPE）.5安全设备.5细胞培养设备 .6基本设备.6扩展设备.7其他用品.7细胞培养实验室 .7无菌工作区.7细胞培养罩.7细胞培养通风橱布局.9培养箱.10储存.10冻存.11细胞计数器.11无菌技术 .12简介.12无菌工作区.12良好的个人卫生.12无菌试剂

3、和培养基.12无菌操作.13无菌技术检查清单 .14iv|细胞培养基础知识仅供教学使用。生物污染 .15简介.15细菌.15酵母.16霉菌.16病毒.17支原体.17交叉污染.18使用抗生素.183.细胞培养基本知识.19细胞系.19选择合适的细胞系.19获取细胞系.20培养环境 .20贴壁培养与悬浮培养.20培养基.21血清.22细胞培养塑料耗材.23pH值.25CO2.25温度.25细胞形态学.26哺乳动物细胞.26哺乳动物细胞形态差异.26293细胞形态.27昆虫细胞 .28Sf21细胞形态.28Sf9细胞形态.294.细胞培养方法.30培养细胞的维持指南 .30什么是传代培养？.30何

4、时进行传代培养.31推荐用于普通细胞系的培养基.32TrypLE解离酶.34细胞培养基础知识|v仅供教学使用。贴壁细胞传代.35所需材料.35贴壁细胞的传代方案.35昆虫贴壁细胞传代注意事项.37悬浮细胞传代.38悬浮培养传代.38悬浮培养容器.38悬浮培养传代.39悬浮细胞的传代方案.39悬浮昆虫细胞传代注意事项.41冷冻细胞 .42冷冻保存.42冷冻保存指南.42冻存培养基.43所需材料.44培养细胞冻存方案.44解冻冻存细胞.45解冻指南.45所需材料.46解冻冻存细胞.465.转染基础知识.47转染简介 .47什么是转染？.47术语.47应用.48转染类型 .49瞬时转染.49稳定转染

5、.50选择转染策略.51基因输送技术.53阳离子脂质体介导的输送.54磷酸钙共沉淀.56DEAE-右旋糖酐介导的输送.57其他阳离子聚合物输送.58病毒输送.59电穿孔.61其他物理输送方法.62 阳离子脂质体介导的转染.63机理.63阳离子脂质体转染试剂.64病毒介导的基因转移 .66病毒载体的主要特点.66常见病毒载体.67Neon转染系统.69稳定转染子的选择.71用于真核细胞的选择性抗生素.71报告基因分析.73转染分析.73基因调控分析.73常用的报告基因.74RNAi和非编码RNA研究.75常用RNAi术语表.75RNAi的工作原理.76siRNA分析.76miRNA分析.77选择

6、RNAi方法.786.转染方法.79转染效率的影响因素 .79细胞类型.79细胞健康与活性.80汇合.81培养基.81血清.82抗生素.82转染分子的类型.83转染方法.83转染方法的选择（非病毒）.84连续细胞系.84原代细胞与有限培养.85病毒DNA输送系统的选择.86哺乳动物细胞表达.86 vi|细胞培养基础知识仅供教学使用。质粒DNA转染指南.87载体考虑因素.87质粒DNA的质量.87基因产物和启动子.88对照.88质粒DNA转染的优化.89磷酸钙-DNA共沉淀法需考虑的因素.89阳离子脂质体转染需考虑的因素.90电穿孔法的考虑因素.93稳定转染子的筛选.94开始前.94杀死曲线.9

7、4筛选过程.95RNAi策略的选择 .96siRNA与基于载体的RNAi 方法比较.96非载体siRNA技术.97siRNA转染.99基于载体的RNAi.99RNA转染指导原则.101RNAi工作流程.101RNA处理.102转染效率.102阳性对照.102阴性对照.103共转染.103siRNA质量.104siRNA的用量.104转染试剂的体积.105细胞密度.105细胞在转染试剂/siRNA复合物中的暴露.105转染过程中血清的存在.105siRNA实验成功的技巧.106siRNA转染优化.107siRNA转染效率的影响因素.107细胞培养基础知识|vii仅供教学使用。附录 .108故障排

8、除 .108细胞培养和转染产物 .109细胞系.109用于哺乳动物细胞培养的培养基.110用于昆虫细胞培养的培养基.111细胞培养血清产品.111细胞培养塑料耗材.112用于细胞培养的实验室试剂.113抗生素和抗真菌剂.114生长因子和纯化蛋白质.115细胞计数仪.116转染试剂.116Neon转染系统.117RNA干扰.1173D细胞培养.118类器官、球状体和3D细胞培养.1183D服务.118用于细胞培养的实验室设备.119CO2培养箱.119生物安全柜.119离心机.119其他资源 .120Gibco虚拟培训实验室.120Gibco癌症基础知识.120Gibco细胞培养大咖.120哺乳

9、动物和昆虫细胞培养物.120细胞和组织分析.120细胞生物学服务.121安全技术说明书.121分析证书.121技术支持.121有限产品质量保证.121参考文献 .122viii|细胞培养基础知识仅供教学使用。细胞培养基础知识|1仅供教学使用。1.引言手册目的本“细胞培养基础知识手册”为“细胞培养基础知识教学视频”（可访问 细胞培养基础知识|3仅供教学使用。如果传代时有多余的细胞，则可使用适当的保护剂（例如DMSO或甘油）处理细胞，并在-130C以下的温度下保存（冷冻保存），直至使用。有关传代培养和冷冻保存细胞的更多信息，请参阅“培养细胞保存指南”，第30页。根据细胞的形状和外观（即形态），可将

10、其分为三大类。冷冻保存培养细胞的形态细胞培养是细胞和分子生物学所使用的一项重要技术，为细胞正常生理和生化研究（如代谢研究、衰老研究）、药物和毒性化合物对细胞的作用、以及致突变性和致癌性研究提供了上佳的模型系统。细胞培养还可用于药物筛选和开发，以及生物化合物（如疫苗、治疗性蛋白质）的大规模生产。在这些应用中，使用细胞培养的一大优势在于，使用来源于同一克隆的一批细胞可获得稳定一致、可重复的结果。细胞培养的应用成纤维（或成纤维细胞样）细胞是双极或多极细胞，呈细长的形状，并附着在基质上生长。上皮样细胞呈多边形，尺寸更规则，并附着在基质上分呈散在斑片状生长。淋巴母细胞样细胞呈球形，通常悬浮而不附着于表面

11、生长。4|细胞培养基础知识仅供教学使用。2.细胞培养实验室安全除大多数日常工作场所常见的安全风险（如电气和火灾危险）外，细胞培养实验室由于要操作和处理人或动物细胞和组织以及一些有毒、有腐蚀性或者有致突变性的溶剂和试剂，因而还具有一些特殊的危险。其中，最常见的一些危险包括:注射器针头或者其他污染锐器刺伤、液体泼溅到皮肤和粘膜上、经口吞入毒物以及吸入感染性气体挥发。任何生物安全程序的基本目的都是为了减少或避免实验室工作人员和外部环境与潜在危害性生物物质的接触。细胞培养实验室中最重要的安全要素是严格遵守标准微生物学准则和技术。美国的生物安全法规和建议载于由疾病控制与预防中心（CDC）和美国国立卫生研

12、究院（NIH）编写，由美国卫生与公共服务部颁布的微生物学及生物医学实验室生物安全准则中。该准则定义了四个递增的防护等级，分别为生物安全一级至四级，介绍了按照操作某一制剂时对应的危险等级应遵守的微生物学准则、应使用的安全设备以及应采取的设施安全措施。生物安全一级（BSL-1）BSL-1是大多数研究和临床实验室常用的基本防护等级，适用于已经明确鉴定的，不会在正常健康人体内引起疾病的活性微生物。生物安全二级（BSL-2）BSL-2适用于已知会通过吸入或经皮或粘膜暴露而引起不同严重程度人类疾病的中等风险生物因子。大多数细胞培养实验室应至少达到BSL-2级，但具体要求取决于所使用的细胞系以及开展工作的类

13、型。生物安全三级（BSL-3）BSL-3适用于已知有可能通过气体挥发传播的本地或外来性生物因子，以及可能导致严重和潜在致命感染的生物因子。生物安全四级（BSL-4）BSL-4级适用于可通过气体挥发传播，对个人造成危及生命的不治之症的外源性生物因子。这些高致病风险的生物因子必须控制在高防护等级的实验室内。生物安全等级有关生物安全等级指南的更多信息，请参阅微生物学及生物医学实验室生物安全准则 第五版，可在cdc.gov/labs/bmbl.html下载。细胞培养基础知识|5仅供教学使用。安全技术说明书（SDS）是一种包含特定物质属性信息的表格，其中包括熔点、沸点和闪点等物理数据，以及关于其毒性、反

14、应性、健康影响、储存、处置、建议使用的防护装备和溢出处理的信息。有关我们产品的SDS，可在 请注意尽量减少气体挥发和泼溅。在实验开始前和结束后，都应对所有工作台面进行消毒。在任何可能具有感染性的材料溢出或溅出后，均应立即使用适当的消毒剂进行消毒。即使未被污染，也应定期清洁实验室设备。在处理废弃物前，应对所有培养物、储存物和其他可能具有感染性的材料进行消毒。若发生了任何可能导致感染性物质泄漏的事件，均应向相应人员（例如，实验室主管、安全员）报告。细胞培养实验室的具体要求主要取决于开展的研究类型；例如，专门从事癌症研究的哺乳动物细胞培养实验室的要求与专门研究蛋白质表达的昆虫细胞培养实验室的要求就存

15、在很大差异。但是，所有细胞培养实验室均有一个共同的要求，即没有病原微生物（即无菌），并且均有一些细胞培养必需的基本设备。本节列出了大多数细胞培养实验室常用的设备和用品，以及使工作更为高效、准确，或可提高检测和分析范围的实用设备。请注意，本清单并非无所不包；任何细胞培养实验室的要求均取决于其开展的工作类型。细胞培养超净工作台（即层流超净台或生物安全柜）培养箱（推荐使用湿式的CO2培养箱）水浴锅 离心机 冰箱和冰柜（-20C）细胞计数仪（例如Invitrogen Countess 3自动细胞计数仪或血细胞计数器）倒置显微镜 液氮（N2）冷冻柜或冻存容器 灭菌器（即高压灭菌器）Basic equip

16、ment 细胞培养基础知识|7仅供教学使用。细胞培养实验室 抽吸泵（蠕动泵或真空泵）pH计 滚轮架（用于扩大单层培养的规模）共聚焦显微镜 流式细胞仪 生物反应器 细胞培养小室 细胞培养容器（例如培养瓶、培养皿、多孔板）移液管和移液器 注射器和针头 废物容器 培养基、血清和试剂 细胞扩展设备其他用品细胞培养实验室的主要要求是需要保持一个仅限于细胞培养工作的无菌工作区。尽管最好使用单独的组织培养室，但在较大实验室中划出一定的细胞培养区同样可用于无菌操作、细胞培养、以及试剂和培养基的储存。提供无菌条件的最简单、经济的方法就是使用细胞培养通风橱（即生物安全柜）。细胞培养通风橱提供了一个无菌工作区，同时

17、可以抑制许多微生物学操作产生的感染性泼溅或气体挥发。细胞培养通风橱有三种，分别为I级、II级和III级，以满足各种研究和临床需求。细胞培养通风橱的类别I级细胞培养通风橱配合良好的微生物学技术，可为实验室人员和环境提供相当水平的保护，但此类通风橱无法防止培养物污染。它们的设计和气流特性类似于化学品通风橱。无菌工作区细胞培养罩8|细胞培养基础知识仅供教学使用。II级细胞培养罩通风橱用于涉及BSL-1、2和3物质的工作，也为细胞培养实验提供所需的无菌环境。II级生物安全柜应用于处理潜在危险材料（例如，来源于灵长类动物的培养物、病毒感染培养物、放射性同位素、致癌或有毒试剂）。II级生物安全柜是目前最常

18、见的细胞培养通风橱类型。III级生物安全柜是气密性设备，可为人员和环境提供能达到的最高水平防护。在涉及已知人类病原体和其他BSL-4材料的工作中，需要使用III级生物安全柜。细胞培养通风橱的气流特性II级生物安全柜保持稳定的、单向的HEPA过滤气流从安全柜顶部吹到工作台面，从而保护工作环境免受灰尘和其他悬浮污染物的影响。这些培养通风橱（即II级BSC）能为使用者和细胞培养物提供显著的保护。超净工作台水平层流或垂直层流“超净工作台”不是生物安全柜；这些设备将经HEPA过滤的气流从安全柜背面经由工作台面吹向使用者，这可能会使使用者接触到潜在的危险物质。这类设备仅能为产品提供保护。超净工作台可用于某

19、些洁净操作（例如无菌设备或电子设备的无尘组装），但在操作细胞培养材料或药物配方，以及处理潜在感染性材料时，请勿使用超净工作台。有关生物安全柜的选择、安装和使用的更多信息，请参阅微生物学及生物医学实验室生物安全准则 第五版，可在cdc.gov/labs/bmbl.html下载。细胞培养实验室 细胞培养基础知识|9仅供教学使用。II级生物安全柜大小应足够一人使用，内外易于清洁，照明充足，使用舒适，且不会导致体位不便。保持细胞培养通风橱内的工作区域干净、整齐，所有物品均在直视范围内。对放置在细胞培养通风橱内的每件物品，用70%乙醇喷洒消毒，并擦拭干净。细胞培养通风橱内物品的排列通常遵循以下右手使用用

20、习惯，在特定应用需要增加其他物品时，可做适当调整。中心工作区域开阔、清晰，用于放置细胞培养容器 移液器置于右前方，玻璃移液管置于左侧，方便拿取 试剂和培养基在右后方，便于吸取 后部中间有放置一个小型容器，用于收集废液细胞培养通风橱布局BIOHAZARDS图2.1.在II级BSC内“从洁净到脏污”工作的典型布局。左侧的洁净培养物（左）可在中央区进行接种；右侧的浅盘用于丢弃受污染的移液器，而生物危险品袋则可盛放其他受污染的材料。对于惯用左手的使用者而言，则可采取相反的排列。10|细胞培养基础知识仅供教学使用。培养箱的用途是为细胞生长提供合适的环境，以模拟细胞所来源的体内条件。培养箱应足够大，有强制

21、空气循环，并应将温度波动控制在 0.2C以内。不锈钢培养箱易于清洁并耐腐蚀，尤其适合于需要潮湿空气条件进行培养的情况。纯铜培养箱的清洁简便，提供了一种易于护理的替代方案。尽管细胞培养箱的无菌性要求不像生物安全柜那么严格，但还是应该经常清洁培养箱以降低细胞培养物的污染风险。培养箱类型培养箱有两大类，水套式和直热式CO2培养箱。水套式培养箱属于较老的技术，但在断电情况下它最能保持箱内状态。直热式培养箱可提供自动高温灭菌选项，但必须专门证明其有效性。在任何情况下，都需要使用风扇进行主动空气循环，以确保整个环境保持一致，并在箱门打开后能够快速恢复。细胞培养实验室应设置多个区域分别用于存放液体（例如培养

22、基和试剂）、化学品（例如药物和抗生素）、耗材（例如一次性移液器、培养容器和手套）、玻璃器皿（例如培养瓶和玻璃移液管）、专业设备以及组织和细胞。玻璃器皿、塑料和专业设备可在室温下存放在架子上和抽屉中。而所有培养基、试剂和化学品则必须按照标签上的说明进行储存。某些培养基、试剂和化学品对光敏感。尽管它们可耐受光照条件下的正常实验使用，但不使用时应将其存放在黑暗条件下或用铝箔包裹起来。冰箱对于小型细胞培养实验室，家用冰箱（最好是没有自动除霜功能的冰箱）是在2-8C下储存试剂和培养基的经济便利之选。对于大型实验室，专供细胞培养使用的冷藏室则更为合适。冰箱或冷藏室都应定期清洁以避免污染。培养箱储存细胞培养

23、实验室（续）细胞培养基础知识|11仅供教学使用。冰柜大多数细胞培养试剂可在-5C至-20C下储存；因此，超低温冰柜（即-80C冰柜）可用于储存大多数试剂。家用冰柜是一种更便宜的选择。虽然大多数试剂可以耐受自动除霜（即自解冻）冰柜中的温度波动，但某些试剂（例如抗生素和酶）应储存在无自动除霜功能的冰柜。随着传代次数的增加，连续培养的细胞系很可能会出现遗传不稳定性；因此，必须准备细胞工作贮备，并将其进行低温储存（更多信息，请参阅“细胞冻存”，第42页）。请勿将细胞储存在-20C或-80C的冰柜中，因为细胞活率在此温度下会下降。液氮储存系统目前主要有两大类：蒸汽相和液相储存系统，分别采用广口和细口储存

24、容器。蒸汽相系统可降低冻存管将爆炸的风险，这对于储存生物危险性材料是必需的，而液相系统通常具有更长的静态维持时间，因此更经济。窄颈容器的氮气蒸发速度较慢且更经济，但宽颈容器的操作更容易，且储存容量更大。细胞计数器对于定量分析细胞的生长动力学至关重要，当在实验室中培养两个或三个以上细胞系时，能提供很大的便利。Countess 3自动细胞计数仪是一款小巧的台式仪器，表面很好清理，可置于细胞培养通风橱中。由于采用先进的机器学习图像分析算法，具有自动光强度调节、聚焦、捕获、计数和保存功能，使用标准的台盼蓝染色摄取技术可在不到一分钟的时间内精准地测量每份样本的细胞计数和存活率（活细胞、死细胞和全部细胞）

25、。只需要插入带有细胞样品的玻片即可。一次性Countess细胞计数板可为您最大程度地提供便利性，可重复使用玻片来实现可持续性并节约成本。Countess 3自动细胞计数仪的上样量与常用的血球计数器血细胞计数仪的上样量相同，通常每份样本的典型细胞计数耗时不到一分钟，适用于多种真核细胞。冻存细胞计数器12|细胞培养基础知识仅供教学使用。细胞培养的成功在很大程度上取决于保护细胞免受细菌、真菌和病毒等微生物的污染。非无菌用品、培养基和试剂、带有微生物的空气悬浮微粒、不干净的培养箱以及工作台面都是生物污染的来源。无菌技术的作用是在环境微生物和无菌的细胞培养之间提供一道屏障，它通过一套操作流程来降低上述来

26、源的污染概率。无菌技术的组成要素包括：无菌工作区、良好的个人卫生、无菌试剂和培养基以及无菌操作。减少空气悬浮微粒和气体挥发（例如灰尘、孢子、脱落的皮屑、喷嚏）污染的最简单经济的方法是使用细胞培养通风橱。II级生物安全柜应正确设置，并放置于细胞培养的专用区域，避免来自于门、窗和其他设备的气流，区域内不能直接穿行。工作台面应保持整齐，只放置特定实验所需的物品；不能用作储存区。使用前后，应对工作台面进行彻底消毒，并定期清洁周围区域和设备。日常清洁时，在工作前和工作期间，特别是在发生任何泼溅后，应使用70%乙醇擦拭工作台面。在细胞培养通风橱中，不需要也不建议使用酒精灯。细胞培养通风橱应始终处于运行状态

27、，只有在长时间不使用时才将其关闭。在进行细胞培养前后均要洗手。除了保护您免受危险物质的侵害外，穿戴个人防护装备还可减少皮屑脱落以及衣服上的灰尘和污垢造成的污染。商品化试剂和培养基均经过严格的质量控制以保证其无菌，但它们在操作过程中可能被污染。请遵循以下指导原则进行无菌操作，避免污染。请始终使用适当的灭菌方法（如高压灭菌器、除菌过滤器）对实验室中配制的任何试剂、培养基或溶液进行灭菌。简介无菌工作区良好的个人卫生无菌试剂和培养基无菌技术 细胞培养基础知识|13仅供教学使用。请始终用70%乙醇擦拭双手和工作区。将容器、培养瓶、培养板和培养皿放入细胞培养通风橱之前，先用70%乙醇擦拭其外部。不要直接从

28、试剂瓶或培养瓶中倾倒培养基和试剂。使用无菌玻璃或一次性塑料移液管和移液器操作液体时，每只移液管只能使用一次，以避免交叉污染。无菌移液管到使用时才能打开其包装。移液管应存放在工作区内。试剂瓶和培养瓶使用后应盖上盖子，多孔板应用胶带密封或放入可重复密封的袋中，以防止微生物和悬浮污染物进入。无菌培养瓶、试剂瓶和培养皿等到使用时才能打开盖子，不得将其开放暴露在环境中。使用后，应立即盖好盖子。盖子取下后，必须开口朝下放置在工作台面上。必须使用无菌的玻璃器皿和其他设备。进行无菌操作时，不要交谈、唱歌或吹口哨。尽可能快速地进行实验，以降低污染风险。无菌操作14|细胞培养基础知识仅供教学使用。无菌技术检查清单

29、下面的清单简单罗列了一些建议和方法，可指导您切实使用无菌技术。有关无菌技术的深入介绍，请参阅动物细胞培养：基本技术和特殊应用指南（Freshney，2016年）。工作区域II级生物安全柜设置是否正确？生物安全柜是否在没有气流和穿行的区域内？工作台面是否整齐，并仅放置了实验的必需物品？开始工作前，您是否使用70%乙醇擦拭了工作台面？您是否定期清洁和消毒了培养箱、冰箱、冰柜和其他实验室设备？个人卫生您洗手了吗？您穿戴个人防护装备了吗？如果您留长发，是否已将其扎在了后面？您是否使用移液器操作液体？试剂和培养基实验室中的任何试剂、培养基和溶液是否都进行了恰当的灭菌处理？在将试剂瓶、培养瓶和培养板放到工

30、作台面之前，您用70%乙醇擦拭其外部了吗？所有的试剂瓶、培养瓶和其他容器在不使用时都盖上了盖子了吗？所有的培养板是否都储存在无菌的重复密封袋中？是否有试剂浑浊或被污染了？试剂中有漂浮颗粒吗？有难闻的气味或异常的颜色吗？如果是，您对它们进行了去污并丢弃吗？操作您操作时是否缓慢、谨慎、且注意无菌技术了？所有物品（包括移液器、瓶和培养瓶）放入细胞培养通风橱之前，表面否都用70%乙醇擦拭过了？您是否将盖子朝下放在工作区内？您是否使用无菌玻璃移液管或一次性无菌塑料移液管操作所有液体？无菌移液管是否只使用一次以避免交叉污染？您是否注意避免让移液器吸头接触到任何非无菌物质？发生泼溅时是否立即吸干，并用70%

31、乙醇擦拭该区域？细胞培养基础知识|15仅供教学使用。生物污染细胞培养物污染往往是细胞培养实验室中最常见的问题，有时会造成非常严重的后果。细胞培养污染物可分为两大类，一类是化学污染物，如培养基、血清和水中的杂质，包括内毒素、增塑剂和洗涤剂，另一类是生物污染物，如细菌、霉菌、酵母、病毒和支原体，以及其他细胞系的交叉污染。虽然污染无法完全消除，但可以通过全面了解其来源并遵循良好的无菌技术来降低污染的发生频率和严重性。本节将概述主要的生物污染类型。细菌是一大类普遍存在的单细胞微生物。细菌的直径通常只有几微米，其形状多样，如球状、杆状和螺旋状等。由于分布广泛、生长迅速和体积大小等特点，细菌以及酵母和霉菌

32、是细胞培养中最常见的生物污染物。细菌污染在培养物感染后几天内就很容易被肉眼观察到；受感染的培养物通常会变得浑浊，有时表面会有一层薄膜。经常还会出现培养基的pH值突然下降的情况。在低倍显微镜下，细菌以细小颗粒的形式出现在细胞之间，在高倍显微镜下观察可以分辨出单个细菌的形状。下面的模拟图像显示了贴壁培养的293细胞被大肠杆菌污染。简介细菌 图2.2.被大肠杆菌污染的贴壁293细胞的模拟相差图像。在低倍显微镜下，贴壁细胞之间有一些发亮的微小颗粒，但单个细菌不易区分（图A）。进一步放大黑色正方形框出的区域后，可以显现出单个大肠杆菌细胞，这些细胞通常呈杆状，长约2 m，直径约0.5 m。图A中黑色正方形

33、的边长为100 m。AB16|细胞培养基础知识仅供教学使用。酵母是真菌界中的单细胞真核微生物，大小从几微米（常见）到40 m（罕见）不等。与细菌污染一样，被酵母污染的培养物会变得混浊，尤其是在污染的后期。被酵母污染的培养物，其pH值几乎没有变化，通常直到污染严重时，pH值才会升高。在显微镜下，酵母呈单个卵球形或球形颗粒，可能还会出芽产生更小的颗粒。下面的模拟图像显示了贴壁293细胞铺板24小时后被酵母感染的情况。酵母霉菌是真菌界的真核微生物，以多细胞丝状体生长，称为菌丝。这些多细胞丝状体构成的交联网络含有遗传性相同的细胞核，被称为集落或菌丝体。与酵母污染相似，培养物的pH值在污染的初期保持稳定

34、，然后随着培养物感染程度加剧而迅速增加，并变得浑浊。在显微镜下，菌丝体通常呈细长的丝状体，有时呈密集的孢子团。许多种霉菌的孢子在休眠阶段能够耐受极其恶劣和不宜生长的环境，当其遇到合适的生长条件时才会被激活。霉菌生物污染（续）图2.3.被酵母污染的贴壁293细胞培养物的模拟相差图像。酵母细胞呈为卵球形颗粒，增殖时会出芽产生更小的颗粒。细胞培养基础知识|17仅供教学使用。病毒是一种微小的感染性病原体，利用宿主细胞的结构进行繁殖。它们的体积极小，难以在培养中被检测到，也难以从细胞培养实验室使用的试剂中去除。由于大多数病毒对宿主有非常严格的要求，因此，它们通常不会对宿主以外物种的细胞培养物产生不良影响

35、。但被病毒感染的细胞培养物会对实验室人员造成严重的健康威胁，尤其是当实验室培养的是人类或灵长类的细胞时。要检测细胞培养物是否被病毒感染，可以使用电子显微镜观察、用抗体组合进行免疫染色、ELISA检测或是使用合适的病毒引物进行PCR扩增。支原体是无细胞壁的简单细菌，被认为是最小的自我复制生物。由于支原体非常小（通常小于1 m），因此很难被检测到，除非它们达到了极高的密度，导致细胞培养物变质；在此之前，通常没有明显的感染迹象。一些生长缓慢的支原体可在培养物中持续存活，而不会导致细胞死亡，但它们可以改变培养体系中宿主细胞的行为和代谢。慢性支原体感染的可能表现包括：细胞增殖率降低、饱和密度下降以及悬浮

36、培养物凝集；但是，检测支原体污染的唯一可靠方法是通过使用荧光染色（例如Hoechst 33258染色）、ELISA、PCR、免疫染色、放射自显影或微生物测定法定期检测培养物。病毒支原体图2.4.无支原体细胞和支原体感染细胞的显微照片。使用Invitrogen MycoFluor支原体检测试剂盒，按照试剂盒操作流程对培养物进行检测。（A）在固定细胞中，MycoFluor试剂可进入细胞核，细胞核着色明显，但核外无荧光物质，表明培养物未被支原体污染。（B）在被支原体感染的固定细胞中，MycoFluor试剂可对细胞核和支原体进行染色，但细胞核相对强烈的荧光会使细胞核上或细胞核周围的支原体显得模糊。然而

37、，远离高亮度细胞核的支原体可被清晰地观察到。（C）在活细胞中，MycoFluor试剂无法进入细胞核，但容易使细胞外结合的支原体染色。试剂盒中所用对照品的发射光谱，与按照操作流程进行染色的支原体的发射光谱非常一致，且强度均匀，便于研究人员区分染色的支原体和其他背景荧光，包括病毒、细菌，以及细胞自发荧光。上述图像使用365 nm激发光、100/1.3 Plan Neofuar物镜以及450 30 nm带通滤光片获得。ABC18|细胞培养基础知识仅供教学使用。虽然不如微生物污染普遍，但许多细胞系与HeLa以及其他快速生长细胞系之间的广泛交叉污染已经是一个明确的问题，会产生严重的后果。从值得信赖的细胞

38、库中获取细胞系，定期检查细胞系的特性，并使用良好的无菌技术进行操作，这些做法都将帮助您避免交叉污染。DNA指纹图谱分析、核型分析和细胞亚型分析可以确定细胞培养物中是否存在交叉污染。请勿在常规细胞培养中使用抗生素，因为抗生素的连续使用会促进耐药菌株的生长，并导致轻度污染持续存在。一旦将抗生素从培养基中去除，就会发展成大规模污染。抗生素的持续使用还可能掩盖支原体感染和其他隐性污染。此外，某些抗生素可能会与细胞发生交叉反应，干扰正在研究的细胞过程。抗生素只能作为对付污染的最后手段且只能短期使用，并应尽快从培养物中去除。如果长期使用抗生素，则应同时进行无抗生素培养，作为检测隐性感染的对照。交叉污染使用

39、抗生素生物污染（续）细胞培养基础知识|19仅供教学使用。3.细胞培养基本知识本节将介绍有关细胞培养的基础知识，包括：为实验选择合适的细胞系、用于细胞培养的培养基要求、贴壁培养与悬浮培养以及Thermo Fisher Scientifc所提供的连续细胞系的形态。请注意，以下信息是细胞培养基础知识的介绍，可作为您研究工作的起点。如需更多详细信息，我们建议您查阅已出版的文献和书籍，以及您所使用产品附带的手册和产品信息表。细胞系为自己的实验选择合适的细胞系时，请注意以下标准：种属：非人类和非灵长类动物细胞系的生物安全限制通常较少，但是否需要使用种属特异性的细胞培养物，则由所要开展的实验来最终决定。功能

40、特征：实验的目的是什么？例如，肝脏和肾脏来源的细胞系可能更适合用于毒性检测。有限细胞系或连续细胞系：虽然选择有限细胞系会使您在表达正常功能方面具有更多的选择，但是连续细胞系往往更容易扩增和维持。正常或转化的细胞系：转化细胞系通常生长速度快，接种效率较高，并且可以连续培养，培养基中需要的血清也较少，但是由于遗传转化，其表型已经发生了永生性变化。生长条件和特性：您对细胞的生长率、饱和密度、克隆形成率以及悬浮生长能力有何要求？例如，要大量表达重组蛋白以获得高产量，您可能应选择生长迅速且能够悬浮生长的细胞系。其他标准：如果您使用的是有限细胞系，您的细胞储备充足吗？细胞系的特性是否明确？需要自己进行验证

41、吗？如果您使用的是异常细胞系，您是否有等效的正常细胞系可用作对照？细胞系稳定吗？如果不稳定，那么这种细胞容易扩增以便为实验提供充足的冻存储备吗？选择合适的细胞系20|细胞培养基础知识仅供教学使用。细胞培养的一大优势在于能够控制细胞繁殖的物理化学环境（即温度、pH值、渗透压、O2和CO2张力）和生理环境（即激素和营养浓度）。除温度外，培养环境由生长培养基控制。虽然细胞培养的生理环境不如其物理化学环境明确，但是通过更好地了解血清成分、确定增殖所需的生长因子以及更好地了解培养过程中的细胞微环境（即细胞间相互作用、气体扩散、细胞-基质相互作用），现在可以采用无血清培养基进行一些细胞系的培养。目前，主要

42、有两种基本的细胞培养体系，一种是使细胞在人工基质上单层生长（贴壁培养），另一种是使细胞在培养基中自由漂浮生长（悬浮培养）。除造血细胞系和其他一些细胞外，大多数脊椎动物细胞均具有贴壁依赖性，必须在合适的基质上培养，且该基质必须经过特殊处理，以便细胞附着和铺展（即经组织培养处理）。但是，许多细胞系也可采用悬浮培养。同样，大多数市售昆虫细胞系在单层或悬浮培养物中生长良好。悬浮培养细胞可在未经组织培养处理的培养瓶中培养，但随着培养物体积与表面积之比（通常为0.2-0.5 mL/cm2）的增加，阻碍了气体的充分交换，因此需要对培养基进行搅拌。这种搅拌一般通过磁力搅拌器或者旋转瓶实现。贴壁培养与悬浮培养培

43、养环境您可以通过原代细胞建立自己的培养细胞系，也可选择从商业供应商或者非盈利性供应商（即细胞库）处购买已经建立的细胞系。声誉良好的供应商提供优质的细胞系，此类细胞系经仔细地完整性检测，可确保培养物无污染物。建议不要从其他实验室借用培养物，因为它们有很高的污染风险。无论其来源如何，使用前均应确保所有新细胞系已经过支原体污染检测。我们为您的细胞培养实验提供各种原代培养物、已建立的细胞系、试剂、培养基、血清和生长因子。附录包含Thermo Fisher Scientifc提供的较常用的细胞系清单（请参阅第108页）。获取细胞系 细胞培养基础知识|21仅供教学使用。细胞的后续实验往往决定了细胞培养的形

44、式和培养基。除了经过标准组织培养处理和未经处理的表面外，还使用了其他表面改良技术来获得预期的细胞培养结果。例如，低细胞结合的表面处理可直接防止贴壁依赖性细胞附着在培养容器的表面，从而在生成细胞球状体的悬浮培养物方面，比未经处理的表面更具优势。将这种系统与旋转瓶相结合，可以大规模生产球状体。贴壁培养悬浮培养适合包括原代细胞在内的大多数细胞类型。适用于已适应悬浮培养的细胞和其他一些无粘附性的细胞（例如造血细胞）需要定期传代，但易于在倒置显微镜下进行目视检验较易传代，但需要每天进行细胞计数和存活率测定，以遵循生长方式；可将培养物稀释以刺激生长采用酶法（例如Gibco TrypLE Express、胰

45、蛋白酶）或机械方法解离细胞无需通过酶法或机械方法解离细胞细胞生长受到表面积限制，从而可能限制细胞产量细胞生长受到培养基中细胞浓度的限制，易于扩大规模培养需要使用经过组织培养处理的容器可在未经组织培养处理的培养容器中进行培养，但需要搅动（如摇晃或搅拌）以便进行充分的气体交换可连续收获产物，用于细胞学研究等多种研究应用可批量收获产物，用于批量生产等多种研究应用培养基是培养环境中最重要的组成部分，因为它为细胞生长提供了必要的营养、生长因子和激素，并调节培养物的pH值和渗透压。尽管最初的细胞培养实验使用从组织提取物和体液中获得的天然培养基进行，但对标准化和培养基质量的需求不断增长，促进了化学成分确定的

46、培养基的发展。培养基的三个基本类别分别是基础培养基、减血清培养基和无血清培养基，三种培养基对血清添加的要求有所不同。基础培养基大多数细胞系在含有氨基酸、维生素、无机盐和碳源（例如葡萄糖）的基础培养基中生长良好，但在这些基础培养基的配方中必须进一步添加血清。减血清培养基在细胞培养实验中，减少血清不良影响的另一种策略是使用减血清培养基。减血清培养基是富含营养物质和动物源性因子的基础培养基配方，可减少所需的血清量。培养基22|细胞培养基础知识仅供教学使用。培养环境（续）优点缺点 成分限定程度增加 性能更加稳定 更易于纯化和下游处理 生产率提高 细胞功能的精确评价 更好地控制生理反应 细胞介质的增强检

47、测 对特定细胞类型培养基配方有所要求 试剂纯度要求更高 生长放缓如果细胞培养基已冷藏（2-8C），请在使用前加热。细胞培养基保持避光储存。暴露于光线会使培养基中细胞生长所需的必需维生素降解。一旦您向细胞培养基添加FBS后，请将完全培养基放入冰箱（2-8C）以保持性能。在2-4周内使用含添加剂的培养基，以减少污染几率和pH值变化的影响。细胞培养基最佳实践方案下面是一些简单的提示和技巧，可以帮助您确保细胞培养基保持最佳性能。我们提供各种经典的基础培养基、减血清培养基和无血清培养基，以及生长无血清培养基无血清培养基（SFM）通过用适当的营养和激素配方替代血清，避免了使用动物血清的问题。无血清培养基配

48、方适用于许多原代培养物和细胞系，包括用于生产重组蛋白的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系、各种杂交瘤细胞系、昆虫细胞系Sf9和Sf21（草地贪夜蛾）以及用作病毒生产宿主的细胞系（例如293、VERO、MDCK、MDBK等）。使用无血清培养基的主要优势之一是，能够通过选择生长因子的适当组合使培养基对特定细胞类型具有选择性。下表列出了无血清培养基的优点与缺点。因子、添加剂、抗生素和试剂，供您进行细胞培养实验。附录包含Thermo Fisher Scientifc提供的更常用的细胞培养产品。如需了解更多信息，请访问 细胞培养基础知识|23仅供教学使用。与小牛和成年牛血清相比，FBS含有少量的丙种球蛋白、较

49、高水平的生长因子和较少的补体蛋白。这使得FBS非常适合于促进增殖细胞生长，同时也降低了哺乳动物细胞在培养物中结合或裂解的可能性，从而成为FBS优先于其他动物血清的合理理由。然而，在培养基中使用血清存在一些缺点，包括成本高，标准化、特异性和差异性方面的问题，以及对某些细胞培养物的不良影响，例如刺激或抑制生长和/或细胞功能。如果血清的来源不可靠，污染也会对成功的细胞培养实验构成严重威胁。我们的Gibco产品（包括血清）经污染检测，其质量、安全性、一致性和合规性均得到保证，可提供多种血清，以满足您从基础研究到专业检测的特定细胞培养需求。无论您需要具有最低病毒风险、最低内毒素水平的血清，还是需要用于专

50、业应用和检测的血清，Gibco产品都能提供卓越的价值。更多信息，请访问 cm2到300 cm2不等，可以是直颈，也可以是弯颈。弯颈具有多个优点，包括使操作人员更容易接触到整个生长表面，有助于防止培养基接触到盖子，并允许从培养瓶中倒出培养基且减少滴落。滚瓶：滚瓶是为疫苗工业规模生产、单克隆抗体和生物治疗等应用而开发的，由PS或聚对苯二甲酸乙二酯（PETG）制成。与培养瓶相比，滚瓶具有更大的生长表面，能够使培养基在细胞上缓慢而稳定地混合，并有助于增加培养基与表面的接触。孔板：细胞培养板的孔数从4个到384个不等，可一次用于多种培养。根据应用的不同，细胞培养板有未经处理、经TC处理或用其他材料处理的

51、培养板。对于TC板，仅处理孔的底部，保持壁的疏水性。经TC处理的孔板可为细胞附着和生长提供一致且相容的表面。培养腔室玻片：培养腔室玻片由一个可拆卸的培养基腔室组成，该腔室与一个经过处理用于贴壁细胞培养的玻片相连。它使您可以在单个显微镜载玻片上进行接种、培养、固定和染色。一些培养腔室玻片具有模拟PDL涂层特性的经化学修饰的生长表面。试管：有多种用于培养、离心或储存细胞的试管。经TC处理的试管可用于培养，而锥形离心管可用于从样本储存到细胞分离等各种应用。有关更多信息，请访问 细胞培养基础知识|25仅供教学使用。大多数正常的哺乳动物细胞系都能在pH值为7.4的环境中生长良好，而且不同细胞株间差异极小

52、。但是，目前发现有些转化细胞系在轻度偏酸性的环境（pH 7.0-7.4）中生长较好，而有些正常的成纤维细胞系更适合在轻度偏碱性的环境（pH7.4-7.7）中生长。Sf9和Sf21等昆虫细胞系在pH值为6.2的环境中生长情况最佳。生长培养基可控制培养物的pH值，为培养细胞pH值的变化提供缓冲作用。通常，这种缓冲作用通过添加有机（例如HEPES）缓冲液或者CO2-HCO3-（碳酸氢盐）缓冲液实现。培养基的pH值取决于溶解态CO2与HCO3-间的精密平衡，因此，空气中CO2含量的变化会改变培养基的pH值。为此，使用含CO2-HCO3-缓冲液的培养基时必须使用外源性CO2，特别是使用开放式培养皿培养细

53、胞或者需要在高浓度条件下进行细胞系培养时。虽然大多数研究人员通常使用的是空气中CO2浓度为5-7%培养基，但是4-10%浓度的CO2适用于大多数细胞培养实验。然而，每种培养基均具有其推荐的CO2张力和碳酸氢盐浓度，以便达到适当的pH值和渗透压；更多信息，请参阅培养基生产商提供的说明书。细胞培养的最佳温度主要取决于分离来源的细胞宿主的体温，此外也部分受到解剖部位体温差异的影响（例如皮肤温度可能低于骨骼肌的温度）。与温度过低相比，细胞培养时温度过高是更为严重的问题；因此，往往将培养箱的温度设定为略低于最佳温度的温度。大多数人类和哺乳动物细胞系在36C至37C下具有最佳生长状态。在27C下培养是昆虫

54、细胞的最佳生长条件；它们在较低温度和27-30C之间的温度下生长较慢。高于30C时，昆虫细胞的存活率降低，即使温度恢复到27C，细胞也无法恢复。禽类细胞系需要38.5C才能实现最大程度的生长。尽管这些细胞在37C时也可以进行培养，但它们的生长速度更慢。源自冷血动物（例如两栖动物、冷水性鱼类）的细胞系可在15C至26C这一较宽的温度范围内生长。请注意，每种细胞类型的细胞培养条件各不相同。偏离特定细胞类型所需培养条件，可能导致异常表型的表达乃至细胞培养彻底失败等后果。因此，我们建议您熟悉您感兴趣的细胞系，并严格遵循实验所用每种产品的随附说明进行操作。pH值CO2温度26|细胞培养基础知识仅供教学使

55、用。细胞形态学哺乳动物细胞定期检查培养细胞的形态（即其形状和外观），对于成功进行细胞培养实验至关重要。除确认细胞的健康状态外，每次处理细胞时都要用肉眼和显微镜检查细胞，这可以使您及早发现任何污染迹象，并在污染扩散到实验室周围其他培养物之前加以控制。细胞变质的迹象包括细胞核周围的颗粒化、细胞与基质的解离以及细胞质空泡形成。变质迹象可能由多种原因引起，包括培养物的污染、细胞系的衰老或培养基中存在有毒物质，也可能仅出现需要更换培养基的迹象。任由变质过度发展将导致不可逆转的后果。大多数哺乳动物培养细胞可以根据其形态分为三个基本类别。成纤维（或成纤维细胞样）细胞为双极或多极，形状细长。其附着在基质上生长

56、。上皮样细胞呈多边形，尺寸更规则，并以离散空斑形式附着在基质上生长。淋巴母细胞样细胞呈球形，通常悬浮生长而不附着于表面。除以上列出的基本类别外，某些细胞还表现出特定于其在宿主中特殊作用的形态特征。神经元细胞以不同的形状和大小存在，但大致可分为两个基本的形态类别，I型具有长轴突，用于长距离传递信号；II型则无轴突。一个典型的神经元从细胞体发出具有许多分支的细胞延伸，该延伸被称为树突树。神经元细胞可分为单极或假单极、双极和多极；其中单极或假单极的树突和轴突发自同一突起；双极的轴突和单个树突位于胞体（包含细胞核的细胞中心部分）的相对两端；多极具有两个以上的树突。哺乳动物细胞形态差异 细胞培养基础知识

57、|27仅供教学使用。293细胞系是使用原代人胚肾建立的永生细胞系，其经剪切的人5型腺病毒DNA转染而来。在该细胞系中表达的腺病毒基因能够使细胞产生非常高水平的重组蛋白。我们提供293细胞系的几种变体，包括适用于在无血清培养基中进行高密度悬浮培养的变体。有关更多信息，请访问我们网站上的哺乳动物细胞培养页面。下面的相差图像显示健康293细胞在贴壁培养（图3.1）和悬浮培养（图3.2）中80%融合度时的形态。请注意，在处于对数期时，应在哺乳动物细胞贴壁培养物达到融合之前对其进行传代（参见“何时进行传代培养”，第31页）。293细胞形态图3.1.贴壁培养的健康293细胞的相差图像。以5104活细胞/c

58、m2的接种密度，将细胞平铺在Gibco 293 SFM II培养基中，并置于37C、含5%CO2的湿润空气的培养箱中，以单层生长。铺板4天后，使用（A）10 x和（B）20 x物镜获得的图像。图3.2.悬浮培养的健康293F细胞的相差图像。以2105活细胞/mL的接种密度，在含Gibco 293 SFM II培养基的摇瓶中开始培养，并置于37C、含5%CO2的湿润空气的培养箱中生长。将细胞按1:3的比例稀释，接种4天后使用（A）10 x和（B）20 x物镜获得的图像。AABB28|细胞培养基础知识仅供教学使用。昆虫细胞Sf21细胞（IPLB-Sf21-AE）是从草地贪夜蛾（秋夜蛾）分离得到的卵

59、巢细胞。其呈球形，大小不等，外观有些许颗粒。可将Sf21细胞解冻并直接用于悬浮培养，以快速扩增细胞储液、杆状病毒储液的繁殖和重组蛋白的生产。因为Sf21细胞牢固地附着在表面，其可以用作转染或空斑试验应用的单层。下图显示了悬浮培养（图3.3）和贴壁培养（图3.4）中健康Sf21昆虫细胞的汇合形态。注意，当昆虫细胞汇合时，应对其进行传代培养（见“何时进行传代培养”，第31页）。Sf21细胞形态图3.3.悬浮培养的健康Sf21昆虫细胞的相差图像。以3105活细胞/mL的接种密度，在含Gibco Sf-900 II SFM培养基的摇瓶中开始培养，并保存在28C、非湿润、环境空气调节培养箱中。接种3天后

60、，使用（A）10 x和（B）20 x物镜获得的图像。图3.4.在Gibco 293 SFM II培养基中以贴壁单层生长的Sf21昆虫细胞的相差图像。以5104活细胞/cm2的接种密度，将细胞平铺在T-25培养瓶中，并在28C、非湿润、环境空气调节培养箱中以单层生长。接种7天后，当培养物汇合时，使用（A）10 x和（B）20 x物镜获得的图像。AABB 细胞培养基础知识|29仅供教学使用。Sf9昆虫细胞系是衍生自草地贪夜蛾亲本细胞系IPLB-Sf-21-AE的克隆分离株，其是杆状病毒表达系统（例如，Invitrogen Bac-to-Bac和Bac-N-Blue表达系统）重组蛋白表达的适宜宿主。

61、尽管在以前昆虫细胞一直使用T型培养瓶和添加血清的基础培养基在固定系统中培养，但昆虫细胞一般并非贴壁依赖性细胞，可以轻松地进行悬浮培养。下图显示了悬浮培养和贴壁培养中健康Sf9昆虫细胞的形态。Sf9细胞牢固地附着于表面，其较小而规则的尺寸使其非常容易形成单层和空斑。Sf9细胞形态图3.5.悬浮培养的健康Sf9昆虫细胞的相差图像。以3105活细胞/mL的接种密度，在含Sf-900 II SFM培养基的摇瓶中开始培养，并保存在28C、非湿润、环境空气调节培养箱中。接种3天后，使用（A）10 x和（B）20 x物镜获得的图像。图3.6.贴壁培养的健康Sf9昆虫细胞的相差图像。以5104活细胞/cm2的

62、接种密度，在含Sf-900 II SFM的T型培养瓶中接种，并保存在28C、非湿润、环境空气调节培养箱中。接种3天后，使用（A）10 x和（B）20 x物镜获得的图像。AABB30|细胞培养基础知识仅供教学使用。4.细胞培养方法本节提供培养细胞的常规传代培养、解冻和冷冻的指导原则和一般步骤。请注意，每种细胞类型的细胞培养条件各不相同。偏离特定细胞类型所需培养条件，可能导致异常表型的表达乃至细胞培养彻底失败等后果。因此，我们建议您熟悉您感兴趣的细胞系，并严格遵循实验所用每种产品的随附说明进行操作。培养细胞的维持指南传代/继代培养，是指去除培养基并将细胞从原培养物转移到新鲜的生长培养基中，通过这一

63、操作使细胞系或细胞株进一步繁殖。接种后，培养细胞的生长从延滞期进入对数生长期，该时期细胞呈指数增殖。当贴壁培养的细胞已占据所有可用基质、没有可用扩增空间，或者悬浮培养的细胞已超过培养基所能支撑的能力，无法进一步生长时，细胞增殖速度就会大大降低或完全停止（图4.1）。为了使培养物细胞密度维持在最佳水平，以便细胞继续生长并刺激进一步增殖，必须将培养物分成若干部分，并添加新鲜培养基。什么是传代培养？104105106Days 0864210Cell densitySubculture Log phase growth 图4.1 培养细胞增长模式特征。半对数图显示细胞密度与培养所用时间的关系。培养细胞

64、通常以标准生长模式增殖。接种培养物后的第一个生长阶段是延滞期，此阶段细胞生长缓慢，处于适应培养环境、为快速生长做准备的状态。滞后期之后是对数期（即“对数式”期）此阶段细胞呈指数增殖，消耗生长培养基中的营养素。当所有生长培养基均被耗尽（即，一种或多种营养物耗尽）或当细胞已占据所有可用基质时，细胞进入静止期/平台期，此时增殖速度降低或完全停止。天数对数期生长传代培养细胞密度 细胞培养基础知识|31仅供教学使用。对于贴壁培养和悬浮培养而言，判断是否需要传代培养的标准大致相同；但是，在哺乳动物细胞系和昆虫细胞系之间则存在一些差异。细胞密度 哺乳动物细胞：应在贴壁培养的细胞处于对数期时，在其达到汇合之前

65、进行传代。正常细胞在达到汇合状态时会停止生长（接触抑制），并且重新接种后需要更长的时间才能恢复。转化细胞即使达到汇合状态后也能继续增殖，但在经过大约两次倍增后通常就会变质。类似地，悬浮细胞应在处于对数生长期时，在其达到汇合状态之前进行传代。达到汇合状态时，悬浮细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。昆虫细胞：应在昆虫细胞处于对数期时，达到汇合状态前进行传代。牢固贴壁的昆虫细胞可在达到汇合状态时传代，虽然此时细胞更容易从培养容器上解离下来，但是如果反复将昆虫细胞在密度超过汇合的状态下传代，细胞的倍增次数会减少，活力会降低，贴壁能力也会下降。另一方面，在达到汇合状态之前，对贴壁培养的昆虫细

66、胞进行传代需要更大的机械力，才能使细胞从单细胞层中脱离。反复在达到汇合状态前传代，会导致细胞倍增次数减少，活力降低，健康度较差。培养基耗竭 哺乳动物细胞：生长培养基pH值降低通常表明乳酸积聚，而乳酸是细胞代谢的副产物。乳酸有细胞毒性，低pH值环境也是细胞培养不利条件。pH值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度，细胞浓度越高，培养基耗竭的速度越快。如果发现pH值迅速降低（0.1-0.2 pH单位），同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代培养。昆虫细胞：培养昆虫细胞所用的生长培养基通常比哺乳动物细胞培养基的酸度大。例如，用于培养Sf9细胞的TNM-FH和Grace培养基的pH值为6.2。与哺乳动

67、物细胞培养过程不同，昆虫细胞生长时培养基的pH值逐渐升高，但通常不超过6.4。然而，与哺乳动物细胞相同的是，昆虫细胞达到较高密度后，生长培养基的pH值将开始下降。何时进行传代培养32|细胞培养基础知识仅供教学使用。传代培养时间表严格按照预定时间表进行细胞传代可确保细胞行为的重复性，便于您监测其健康状况。从某一接种密度开始逐渐调整细胞接种密度，直到达到适合该细胞的稳定生长速度和产量。细胞偏离该确定的生长模式通常表示细胞健康状况不佳（例如：变质、污染）或者培养体系的某一组分功能异常（例如：未达到最佳温度，培养基过于陈旧）。我们强烈建议您保存保留详细的细胞培养记录，记录加料和传代时间、所用培养基种类

68、、解离方法、分种率、形态学观察结果、接种浓度、产量和抗生素用法。最好按照传代时间安排开展实验和其它非常规操作（如更换培养基种类）。如果您的实验安排与常规传代时间安排不吻合，则应确保当细胞仍处于滞后期或达到汇合状态、停止生长时，不进行传代。许多哺乳动物连续细胞系均可采用相对简单的培养基（如添加了血清的MEM培养基）进行培养，而采用MEM培养基培养的细胞同样也可采用DMEM或Gibco培养基199进行培养。但是，当表达特定功能时，可能需要更复杂的培养基。通常，有关为某种细胞类型选择合适培养基的信息可在已发表文献以及从细胞来源机构或细胞库获得。如果无法找到关于您的细胞该选择何种培养基的信息，您可根据

69、经验选择生长培养基和血清，或者测试几种不同的培养基，以获得最佳结果。通常，贴壁细胞培养最好从MEM培养基开始，悬浮细胞培养最好从RPMI 1640培养基开始。下列条件，可作为建立新的哺乳动物细胞培养的指南。用于昆虫细胞培养的生长培养基（例如：TNM-FH和Grace培养基）通常比哺乳动物细胞培养基酸度大。推荐用于普通细胞系的培养基培养细胞的维持指南（续）细胞培养基础知识|33仅供教学使用。哺乳动物细胞培养细胞系细胞类型种属组织培养基*293成纤维细胞人胚肾MEM，10%FBS3T6成纤维细胞小鼠胚胎DMEM，10%FBSA549上皮细胞人肺癌F-12K，10%FBSA9成纤维细胞小鼠结缔组织D

70、MEM，10%FBSAtT-20上皮细胞小鼠垂体瘤F-10，15%马血清和2.5%FBSBALB/3T3成纤维细胞小鼠胚胎DMEM，10%FBSBHK-21成纤维细胞仓鼠肾GMEM，10%FBS；或MEM，10%FBS和NEAABHL-100上皮细胞人乳腺McCoy s 5A，10%FBSBT成纤维细胞牛陀螺状细胞MEM,10%FBS和NEAACaco-2上皮细胞人结肠癌MEM,20%FBS和NEAAChang上皮细胞人肝BME，10%calf serumCHO-K1上皮细胞仓鼠卵巢F-12，10%FBSClone 9上皮细胞大鼠肝F-12K，10%FBSClone M-3上皮细胞小鼠黑色素瘤

71、F-10，15%马血清和2.5%FBSCOS-1、COS-3、COS-7成纤维细胞猴肾DMEM，10%FBSCRFK上皮细胞猫肾MEM,10%FBS和NEAACV-1成纤维细胞猴肾MEM，10%FBSD-17上皮细胞犬骨肉瘤MEM,10%FBS和NEAADaudi淋巴母细胞人来自淋巴瘤患者的血液RPMI 1640，10%FBSGH1、GH3上皮细胞大鼠垂体瘤F-10，15%马血清和2.5%FBSH9淋巴母细胞人T细胞淋巴瘤RPMI 1640，20%FBSHaK上皮细胞仓鼠肾BME，10%calf serumHCT-15上皮细胞人结直肠腺癌RPMI 1640，10%FBSHeLa上皮细胞人宫颈癌

72、MEM，10%FBS和NEAA（悬浮，S-MEM）HEp-2上皮细胞人喉癌MEM，10%FBSHL-60淋巴母细胞人早幼粒细胞白血病RPMI 1640，20%FBSHT-1080上皮细胞人纤维肉瘤MEM，10%HI FBS和NEAAHT-29上皮细胞人结肠癌McCoy s 5A，10%FBSHUVEC内皮细胞人脐带F-12K，10%FBS和100 g/mL肝素I-10上皮细胞小鼠睾丸肿瘤F-10，15%马血清和2.5%FBSIM-9淋巴母细胞人来自骨髓瘤患者的骨髓RPMI 1640，10%FBSJEG-2上皮细胞人绒毛膜癌MEM，10%FBSJensen成纤维细胞大鼠肉瘤McCoy s 5A，

73、5%FBSJurkat淋巴母细胞人淋巴瘤RPMI 1640，10%FBSK-562淋巴母细胞人髓细胞性白血病RPMI 1640，10%FBSKB上皮细胞人口腔癌MEM,10%FBS和NEAAKG-1原始粒细胞人来自红白血病患者的骨髓IMDM，20%FBSL2上皮细胞大鼠肺F-12K，10%FBSLLC-WRC 256上皮细胞大鼠肉瘤培养基199，5%马血清McCoy成纤维细胞小鼠未知MEM，10%FBSMCF7上皮细胞人乳腺癌MEM，10%FBS，NEAA和10 g/mL胰岛素WI-38上皮细胞人胚肺BME，10%FBSWISH上皮细胞人羊膜BME，10%FBSXC上皮细胞大鼠肉瘤MEM,10

74、%FBS和NEAAY-1上皮细胞小鼠肾上腺肿瘤F-10，15%马血清和2.5%FBS昆虫细胞培养Sf9,Sf21秋夜蛾（草地贪夜蛾）蛹卵巢TNM-FH，10%FBS；或Gibco Sf-900 II SFM（无血清）或Sf-900 III SFM（无血清）High Five (BTI-TN-5B1-4)粉纹夜蛾（拟尺蠖）卵巢TNM-FH，10%FBS；或Express Five SFM（无血清）Schneider 2(S2),D.Mel-2果蝇（黑腹果蝇）胚胎Schneider果蝇培养基，10%热灭活FBS*BME：Eagle基础培养基；DMEM：DMEM改良基础培养基；FBS：胎牛血清；GM

75、EM：Glasgow最低必需培养基；IMDM：Iscove改良的DMEM；MEM：最低必需培养基；NEAA：非必需氨基酸溶液；TNM-FH：粉纹夜蛾培养基-Hink配方（即：含添加剂的Grace昆虫培养基）。34|细胞培养基础知识仅供教学使用。贴壁细胞传代的第一步是通过酶或机械方法将细胞从培养容器表面解离下来。下表列出了各种细胞解离程序。推荐用于普通细胞系的培养基Gibco TrypLE Express和TrypLE Select酶是利用微生物生产的细胞解离酶，其动力学性质和裂解特异性均与胰蛋白酶类似。虽然TrypLE酶可直接替代胰蛋白酶用于细胞解离操作，无需更改实验流程，但是我们建议您开始时

76、应优化解离的孵育时间。由于TrypLE酶是一种重组真菌胰蛋白酶样蛋白酶，适用于需要使用非动物源性试剂的领域。下表将TrypLE Express和TrypLE Select酶与胰蛋白酶进行了比较。有关更多信息，请访问 Express和TrypLE Select酶胰蛋白酶完全非动物和人类来源的衍生组分猪源性或牛源性室温下稳定室温下不稳定无需血清抑制需血清抑制无需胰蛋白酶灭活剂需要胰蛋白酶灭活剂 细胞培养基础知识|35仅供教学使用。以下实验方案介绍了贴壁培养哺乳动物细胞传代的一般流程。请注意昆虫细胞与哺乳动物细胞传代的一些关键步骤有所不同。有关更多信息，请参见下一页的“昆虫细胞传代培养注意事项”。我

77、们建议您在进行细胞系传代时，严格按照实验中所用每种产品的随附说明进行操作，偏离特定细胞类型所需培养条件，可能导致异常表型的表达乃至细胞培养彻底失败等后果。含贴壁细胞的培养容器 经组织培养表面处理的培养瓶、孔板、培养皿 完全生长培养基，预热至37C 15 mL的一次性无菌试管 37C培养箱，含5%二氧化碳的湿润空气 不含钙、镁或酚红的平衡盐溶液，例如杜氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）解离试剂，例如胰蛋白酶或TrypLE Express酶，不含酚红 用于测定活细胞计数和总细胞计数的试剂和设备（例如，Countess3自动细胞计数仪）所有与细胞接触的溶液和设备必须无菌。请始终使用正确的的无菌技术，并在生

78、物安全柜中操作。1.从培养容器中取出并丢弃已废细胞培养基。所需材料贴壁细胞的传代方案贴壁细胞传代2.使用不含钙和镁的平衡盐溶液洗涤细胞（每10 cm2培养表面积约2 mL）。向培养容器附着细胞层的对侧缓慢添加洗涤液，以避免干扰细胞层，并来回摇动数次培养容器。注意：洗涤步骤会去除任何抑制试剂解离作用的痕量血清、钙和镁。3.从培养容器中取出并丢弃洗涤液。36|细胞培养基础知识仅供教学使用。4.向培养瓶一侧添加预热的解离试剂，例如胰蛋白酶或TrypLE酶；使用足够的试剂覆盖细胞层（每10 cm2约0.5 mL）。轻轻摇动容器以完全覆盖细胞层。5.将培养容器在室温下孵育约2分钟。请注意，实际孵育时间随

79、所用细胞系而异。6.在显微镜下观察细胞是否解离。如果细胞脱离不到90%，则继续孵育几分钟，每30秒检查解离状况。您也可以轻轻摇晃培养容器以加速细胞解离。7.当 90%的细胞已解离时，倾斜培养容器至少一段时间，使细胞排出。添加相当于2倍体积（解离试剂体积的两倍）的预热完全生长培养基。通过几次移液，从细胞层表面分离培养基。8.将细胞转移到一个15 mL的锥形管中，并以200 g离心5-10分钟。请注意，离心速度和时间因细胞类型而异。9.将细胞团块重悬在最小体积的预热完全生长培养基中，取出样品进行计数。10.使用血细胞计数仪、细胞计数仪、台盼蓝拒染法或Countess 3自动细胞计数仪，测定细胞总数

80、和活细胞百分比。如有必要，向细胞中添加生长培养基以达到所需的细胞浓度，并重新计数细胞。11.将细胞悬浮液稀释至细胞系的推荐接种密度，并将适当体积的细胞移液至新的细胞培养容器中，然后将细胞放回培养箱。注意:如果使用培养瓶，在将其放回培养箱之前，如您使用的不是带透气盖的透气培养瓶，请先打开瓶盖，以便进行适当的气体交换。贴壁细胞传代（续）细胞培养基础知识|37仅供教学使用。尽管昆虫细胞传代培养的一般步骤与哺乳动物细胞相同，但这些培养体系的一些关键要求不尽相同。为获得最佳效果，请始终遵循在实验中您所用每种产品的随附说明。昆虫细胞在对数期传代。然而，如果您的昆虫细胞贴壁能力很强，您可在其达到汇合状态或刚

81、刚脱离培养瓶底部时进行传代。细胞更容易脱离。细胞密度低于汇合状态的20%时，细胞生长会受到抑制。对数期收集的细胞是最健康的。昆虫细胞培养时，不建议进行二氧化碳交换。将昆虫细胞保存在27C的非湿润环境中。可将细胞避光保存在室温条件下的试验台上或抽屉里。但是，还是推荐27C的受控环境进行培养。使用昆虫细胞专用的培养基。在无血清条件下，昆虫细胞会非常紧密地附着于基质上，需要额外的力才能解离。要使这些细胞脱离，您可能需要借助手腕的快速运动来摇动培养瓶。为避免污染，在执行此步骤前请务必拧紧瓶盖。注意:我们不建议剧烈摇动培养瓶，因为这可能会损伤细胞。昆虫贴壁细胞传代注意事项38|细胞培养基础知识仅供教学使

82、用。以下方案描述了哺乳动物悬浮细胞传代的一般步骤。请注意昆虫细胞与哺乳动物细胞传代的一些关键步骤有所不同。有关更多信息，请参见“昆虫悬浮细胞传代注意事项”，第41页。为了传代细胞系，我们建议您严格按照实验中所用每种产品的随附说明进行操作。偏离特定细胞类型所需培养条件，可能导致异常表型的表达乃至细胞培养彻底失败等后果。悬浮细胞传代比贴壁细胞传代复杂程度略低。因为细胞已经悬浮在生长培养基中，所以无需进行酶处理即可将其从培养容器表面解离下来，整个过程更快，对细胞的损伤更小。在悬浮培养中不进行生长培养基的更换；相反，每2-3天喂养一次细胞，直到细胞达到汇合状态。这可以通过如下方法实现：直接稀释培养瓶中

83、的细胞并使其继续扩增，或通过从培养瓶中取出一部分细胞并将剩余细胞稀释至适合细胞系的接种密度。通常，传代后的延滞期比贴壁培养所观察到的更短。悬浮培养物可以保存在未经组织培养处理的无菌培养瓶中；但是，专门为悬浮细胞培养设计的转瓶（即搅拌瓶）可以进行更好的气体交换并允许培养更大体积的细胞。还可能使用置于架子上的旋转滚瓶，以搅拌悬浮培养物。转瓶有两种基本设计：通过悬挂搅拌棒组件或垂直叶轮搅拌（即搅动）培养基。垂直叶轮可实现更好的通气。为适当通气，旋转瓶中培养物的总体积不应超过旋转瓶标示体积的一半（例如，500 mL旋转瓶中的培养物不得超过250 mL）。悬浮培养传代悬浮培养容器悬浮细胞传代Vertic

84、alimpellerHangingstir bar悬挂搅拌棒垂直叶轮 细胞培养基础知识|39仅供教学使用。含悬浮细胞的培养容器 不带挡板的摇瓶或转瓶（参见上页“悬浮培养容器”）完全生长培养基，预热至37C 37C培养箱，5%CO2的湿润空气 磁力搅拌器（如果使用旋转瓶）、滚轮架（如果使用滚瓶）或振荡平台（如果使用传统培养瓶或皮氏培养皿）用于测定活细胞计数和总细胞计数的试剂和设备（例如，Countess3自动细胞计数仪）所有与细胞接触的溶液和设备必须无菌。请始终使用正确的无菌技术，并在生物安全柜中操作。在细胞达到汇合状态之前处于对数生长期时传代。达到汇合状态时，悬浮细胞会聚集成团块，转动培养瓶时

85、培养基会变得浑浊。传代前的最大推荐细胞密度因细胞系而异；有关详细信息，请参见对应细胞产品单页或手册。摇瓶中的细胞培养以下方案是在振荡培养箱中使用摇瓶，哺乳动物细胞悬浮传代培养的一般步骤。有关详细方案，请参见特定细胞产品插页。注意：确保摇瓶没有挡板（即，设计用于搅拌的培养瓶底部的凹槽），因为影响振荡频率。1.当细胞准备好传代时（即，在达到汇合状态前的对数生长期），从振荡培养箱中取出培养瓶，并使用无菌移液管从培养瓶中取出少量样品。如果细胞在取样前已经沉淀，则旋转培养瓶使细胞均匀分布在培养基中。2.使用Countess 3自动细胞计数仪或血细胞计数仪、细胞计数仪和台盼蓝拒染法，测定样品中细胞总数和活

86、细胞百分比。3.计算需要添加的培养基体积，将培养基稀释至推荐接种密度。4.以无菌方式，向培养瓶中加入适量的预热培养基。如需要，您可以将培养物分为若干小份，加入多个培养瓶。悬浮培养传代悬浮细胞的传代方案40|细胞培养基础知识仅供教学使用。5.将培养瓶盖拧松一整圈，以便进行适当的气体交换（或使用透气盖），然后将培养瓶放回振荡培养箱中。振荡速度取决于细胞系。注意：为最大限度地减少摇瓶培养物中细胞碎片和代谢副产物废物的蓄积，以100 g的速度轻轻离心细胞悬浮液5-10分钟，并每3周（或按需）将细胞团块重悬于新鲜的生长培养基中。旋转瓶中的细胞培养以下方案是使用转瓶进行哺乳动物细胞悬浮传代培养的一般步骤。

87、有关详细方案，请参见特定细胞产品插页。请注意，细胞对物理剪切很敏感。确保叶轮旋转自如，且不会接触容器壁或底部。叶片顶部应略高于培养基，以确保培养物充分通气。调整旋转器机制，使叶片远离容器的侧面和底部。下表列出了不同旋转瓶尺寸所需培养基的最低体积。旋转瓶尺寸培养基最低体积100 mL30 mL250 mL80 mL500 mL200 mL我们不建议直接在大于500 mL的转瓶中直接开始旋转培养。我们建议从已经验证的小体积转瓶开始逐步扩大培养规模。1.当细胞准备好传代时（即，在达到汇合状态前的对数生长期），从振荡培养箱中取出培养瓶，并使用无菌移液管从培养瓶中取出少量样品。如果在取样前细胞已经沉淀，

88、则旋转培养瓶使细胞均匀分布在培养基中。2.使用Countess3自动细胞计数仪或血细胞计数仪、细胞计数仪和台盼蓝拒染法，测定样品中细胞总数和活细胞百分比。3.计算需要添加的培养基体积，将培养基稀释至推荐接种密度。悬浮细胞传代（续）细胞培养基础知识|41仅供教学使用。4.以无菌方式，向培养瓶中加入适量的预热培养基。如需要，您可以将培养物分为若干小份，加入多个培养瓶。5.将转瓶一侧的盖拧松一整圈，以便进行适当的气体交换，然后将培养瓶放回培养箱中。旋转器速度取决于细胞系和叶轮类型。确保旋转器速度保持在推荐值范围内，以免剪切应力损坏细胞。注意:为最大限度地减少旋转瓶培养物中细胞碎片和代谢副产物废物的蓄

89、积，以100 g的速度轻轻离心细胞悬浮液5-10分钟，并每3周（或按需）将细胞团块重悬于新鲜的生长培养基中。尽管昆虫细胞传代培养的一般步骤与哺乳动物细胞相同，但这些培养体系的一些关键要求不尽相同。为获得最佳效果，请始终遵循在实验中您所用昆虫细胞系的随附说明。悬浮培养细胞时，无需更换培养基。常规传代培养需要去除细胞悬浮液，并添加足以将培养物稀释至适当密度的培养基（参见特定的细胞产品插页）。添加新鲜培养基足以补充细胞营养。昆虫细胞培养时，不推荐进行二氧化碳交换。将昆虫细胞保存在27C的非湿润环境中。可将细胞保存在室温条件下的试验台或抽屉中；但是，推荐将操作温度控制在27C左右。使用专门为昆虫细胞培

90、养而配制的培养基。使用表面活性剂减少剪切。0.1%Gibco Pluronic F-68表面活性剂建议用于旋转器昆虫培养，因为它可以减少由于叶轮作用力对细胞膜造成的剪切力损伤。注意:Sf-900 II SFM和Express Five SFM已含有表面活性剂。某些昆虫细胞系可能需要调整以适应悬浮培养。有关更多信息，请参见特定的细胞系产品插页或手册。悬浮昆虫细胞传代注意事项42|细胞培养基础知识仅供教学使用。连续培养的细胞系容易发生遗传漂变；有限细胞系必定会衰老；所有细胞培养物都容易受到微生物污染；即使是运营状态最佳的实验室也可能出现设备故障。由于已建立的细胞系是一种宝贵资源，并且其更换昂贵且耗

91、时，将其冷冻以进行长期储存至关重要。传代时若有少量富余细胞，应尽快将其作为种细胞储备进行冻存及保管，不得用于常规实验用途。利用冻存的种细胞储备可以制作及补充工作细胞储备。如果工作细胞储备耗尽，冷冻保存的可用作制备新鲜，这样与初始冷冻时相比传代次数增加最少。冷冻保存培养细胞的最佳方法是在含有二甲基亚砜（DMSO）等冷冻保护剂的情况下，将其储存在完全培养基的液氮中。冷冻保护剂可降低培养基的凝固点，同时可降低冷却速度，从而大大降低了晶体形成的风险，因为晶体会损伤细胞并导致细胞死亡。注意：二甲基亚砜能促进有机分子进入组织。处理含有二甲基亚砜的试剂时，应选择适用于此类材料的设备和做法，以免面临危险。遵守

92、地方法规，废弃处置试剂。对于冷冻保存细胞系以备将来使用，遵循以下指南至关重要。与其他细胞培养步骤一样，为了获得最佳结果，我们建议您严格遵循细胞系的随附说明。冷冻保存培养细胞时，确保尽可能保存高浓度和低传代数的细胞。请确保冷冻前细胞的存活率不低于90%。请注意，最佳冷冻条件取决于所用细胞系。使用温度受控冷冻箱或冷冻容器（例如：Thermo Scientifc Mr.Frosty梯度降温盒）以约每分钟1C的速度降低温度，缓慢冷冻细胞。请始终使用推荐的冻存培养基。冻存培养基应含有冷冻保护剂，如二甲基亚砜或甘油（参见“什么是传代培养？”，第30页）。将冷冻细胞储存在-70C以下；在-50C以上，冷冻细

93、胞开始变质。冷冻保存冷冻保存指南冷冻细胞 细胞培养基础知识|43仅供教学使用。请始终使用无菌冻存管储存冷冻细胞。可将含有冷冻细胞的冻存管浸入液氮或液氮上方的气相中储存（参见下文安全注意事项）。请始终穿戴个人防护设备。所有与细胞接触的溶液和设备必须无菌。请始终使用适当的无菌技术，并在生物安全柜中操作。安全注意事项生物危险性材料必须储存在液氮上方的气相中。将密封的冻存管储存在气相中可消除爆炸风险。如果您使用液相储存，请注意玻璃和塑料冻存管的爆炸危险，并始终佩戴面罩或护目镜。冷冻保存细胞时，请始终使用推荐的冷冻培养基。冻存培养基应含有冷冻保护剂，例如二甲基亚砜或甘油。您也可以使用特殊配方的冷冻保存完

94、全培养基，例如Gibco Recovery细胞培养冻存培养基或Synth-a-Freeze冻存培养基。Recovery细胞培养冻存培养基是一种用于哺乳动物细胞培养的即用型冻存完全培养基，含有优化比例的胎牛血清和牛血清，以提高细胞存活率和细胞解冻后的回收。Synth-a-Freeze冻存培养基是一种化学成分明确的无蛋白无菌、且含10%二甲基亚砜的冻存培养基，适用于除黑素细胞以外的多种干细胞和原代细胞类型的冷冻保存。有关更多信息，请访问 完全生长培养基 冷冻保护剂，例如二甲基亚砜（留用于细胞培养的瓶子；仅能在层流净化罩中打开）或冷冻培养基，如Synth-a-Freeze冻存培养基或Recovery

95、细胞培养冻存培养基 15或50 mL的一次性无菌锥形管 用于测定活细胞计数和总细胞计数的试剂和设备（例如，Countess 3自动细胞计数仪）无菌低温冻存瓶 温度受控冷冻装置或异丙醇冻存室盒 液氮储存容器为冻存贴壁细胞，除上述材料外，您需要：不含钙、镁或酚红的平衡盐溶液，例如杜氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）解离试剂，例如胰蛋白酶或TrypLE Express酶，无酚红以下方案是冻存培养细胞的一般步骤。有关详细方案，请参见特定细胞产品插页。1.制备冷冻培养基，在2-8C下储存，直至使用。请注意，合适的冷冻培养基取决于细胞系种类。2.对于贴壁细胞，请按照传代培养过程中使用的操作，将细胞从组织培养容器

96、中轻轻解离下来。将细胞重悬在该细胞类型所需的完全培养基中。3.使用血细胞计数仪、细胞计数仪、台盼蓝拒染法或Countess3自动细胞计数仪，测定细胞总数和活细胞百分比。根据所需的活细胞密度，计算所需的冻存培养基体积。4.以大约100-200 g的速度，将细胞悬浮液离心5-10分钟。在不干扰细胞团块的情况下，无菌倾析上清液。注意:离心速度和持续时间因细胞类型而异。所需材料培养细胞冻存方案冷冻细胞（续）细胞培养基础知识|45仅供教学使用。解冻冻存细胞5.将细胞团块重悬于特定细胞类型的推荐存活细胞密度的冻存培养基中。6.将细胞悬浮液等分至低温冻存管中。等分时，要经常轻轻混合细胞以保持细胞悬浮液均匀。

97、7.在温度受控冷冻装置中冻存细胞，每分钟温度降低约1C。另一种方法是，将含有细胞的冻存管放置在异丙醇冻存盒中，并储存在-80C下过夜。8.将冷冻细胞转移到液氮中，并储存在液氮上方的气相中。解冻过程对冻存细胞有压力，使用良好的技术迅速操作，可以确保在该过程中细胞更高的存活率。与其他细胞培养操作一样，为获得最佳结果，我们建议您严格遵循细胞和其他试剂的随附说明。在37C的水浴中快速解冻冻存细胞（1分钟）。使用预热的生长培养基缓慢稀释解冻的细胞。以高密度铺板解冻的细胞，优化回收率。始终使用适当的无菌技术，并在生物安全柜中操作。请始终穿戴个人防护装备，包括面罩或护目镜。解冻时，储存在液相中的冷冻小瓶存在

98、爆炸风险。一些冷冻培养基中含有二甲基亚砜，其能促进有机分子进入组织。处理含有二甲基亚砜的试剂时，应选择适用于此类材料的设备和做法，以免面临危险。解冻指南46|细胞培养基础知识仅供教学使用。解冻冻存细胞（续）装有冻存细胞的冻存管 完全生长培养基，预热至37C 一次性无菌离心管 37C的水浴 70%乙醇 经组织培养处理的培养瓶、孔板、培养皿以下方案是冻存细胞解冻的一般步骤。有关详细方案，请参见特定细胞产品插页。1.从液氮储存中取出装有冷冻细胞的冻存管，并立即将其放入37C的水浴中。2.通过在37C水浴中轻轻旋转冻存管，快速解冻细胞（90%的汇合度 高通量Lipofectamine 2000 CD

99、性能与Lipofectamine 2000试剂相同，经过认证，不含动物源性成分（“CD”=化学成分确定）图例符号解释符号解释符号解释符号解释质粒DNA，用于蛋白质、shRNA和miRNA表达非编码RNA，用于RNAi基因表达抑制共转染，用于RNAi载体和siRNA共转染CRISPR-Cas9，用于蛋白质输送质粒DNA，用于蛋白质表达mRNA，用于蛋白质表达寡核苷酸，用于基因表达的反义抑制 细胞培养基础知识|65仅供教学使用。转染试剂载体主要特点和应用RNA试剂Lipofectamine RNAiMAX 推荐用于Stealth RNAi和Silencer Select siRNA、Dicer酶切

100、siRNA库、mirVana miRNA模拟物和抑制剂、mRNA和snRNA的瞬时转染 所需RNAi浓度低，基因抑制效果更好，非特异性效应极少 加入10倍浓度范围的转染试剂，细胞毒性无明显变化 适用于多种细胞类型 高通量 只需较少的RNAi即可获得最高的抑制效果 体外转染Lipofectamine MessengerMAX 在神经元（2倍）和各种原代细胞类型中的转染效率最高 使用Cas9 mRNA提升了基因编辑结果 更快速的蛋白表达，无基因组整合风险Invivofectamine 3.0 通过系统输送，在体内高效转染siRNA 高效的mRNA、蛋白质和功能抑制 低毒性，易于使用Oligofec

101、tamine 反义寡核苷酸转染 高通量 高特异性，无毒性 适合低汇合度细胞（转染时达30-50%汇合）蛋白生产试剂Lipofectamine CRISPRMAX 首个优化的脂质纳米颗粒转染试剂，用于转染CRISPR-Cas9蛋白 经验证的裂解效率，在20多种细胞类型中进行检验，包括iPSC、mESC、N2A、CHO、A549、HCT116、HeLa、HEK293和多种其他类型 细胞毒性低启动实验所需的细胞较少 高通量友好型96孔的理想转染解决方案 易于扩大规模高通量实验的理想转染解决方案ExpiFectamine 293 转染高密度293悬浮细胞培养物用于生物生产 转染增强剂可提高性能和蛋白质

102、表达水平，产量较适用于高密度293细胞培养物的其他转染试剂高2至10倍 稳定且可重复的转染结果 将转染规模从不足1 mL扩大至超过10 L，同时可获得相同的单位体积蛋白产量FreeStyle MAX 适用于快速、大规模的哺乳动物瞬时蛋白表达，可用于生物生产 高蛋白产量，可达毫克级 适合悬浮CHO细胞的瞬时转染，也可用于HEK293细胞293fectin 与FreeStyle 293表达系统配合使用，用于瞬时蛋白生物生产 适合悬浮培养的FreeStyle 293-F细胞Optifect 适合低汇合度细胞（转染时 70%汇合）适用于对转染试剂敏感的细胞系Cellfectin 适合昆虫细胞的转染，包

103、括S2、Sf9、Sf21和High Five细胞DMRIE-C试剂 适合悬浮细胞的转染，包括CHO、淋巴和Jurkat细胞系66|细胞培养基础知识仅供教学使用。病毒介导的基因转移对于难以采用脂质体介导进行转染的细胞类型，则通常使用病毒载体。病毒介导的转染又称为转导，它为难以转染的细胞类型提供了一种方法，可用于蛋白质过表达或抑制，是临床研究中最常用的方法（Glover等人，2005；Pfeifer和Verma，2001）。病毒转导的主要优点之一在于，该过程可以在活体内（体内）或培养细胞（体外）中进行，基因输送效率达95-100%。病毒载体可根据其特定的应用量身定制，但必须遵守下列主要特性。安全性

104、：病毒载体有时来源于病原性病毒，应对其进行适当的修饰，使病毒操作的风险最小化。通常需要敲除对病毒复制至关重要的部分病毒基因组，使病毒高效感染细胞并导入病毒载体，但应防止在无辅助病毒存在的情况下生成新的病毒粒子，提供缺失的关键蛋白质。但目前病毒载体使用的安全问题是插入突变，病毒DNA染色体异位整合会破坏肿瘤抑制基因的表达或激活原癌基因，从而引起细胞的恶性转化（Glover等人，2005）。低毒性：病毒载体应尽量不对其感染的细胞的生理学造成影响。这对于需要体内基因导入的研究尤为重要，因为如果载体被视为外来入侵者，则生物体将发挥免疫应答作用（Nayak和Herzog，2009）。稳定性：一些病毒具有

105、遗传不稳定性，会迅速重新排列基因组。这会对使用病毒载体的操作的可预测性和可重复性产生不利影响。因此，通常避免使用不稳定的载体。细胞类型特异性：大部分病毒载体被设计成能感染尽可能多的细胞类型。但有时相反的情况更为可取。可以修饰病毒受体，使病毒靶向特定种类的细胞。该病毒修饰方法称为假型化。选择性：病毒载体应包含可选择的标记物，如特定的抗生素抗性，从而可以分离出摄取了病毒载体的细胞。病毒载体的主要特点 细胞培养基础知识|67仅供教学使用。腺病毒是一种具有广泛细胞嗜性的DNA病毒，可以瞬时转导几乎所有哺乳动物细胞类型。腺病毒通过结合柯萨奇病毒/腺病毒受体（CAR）进入靶细胞（Bergelson等人，1

106、997）。腺病毒与CAR结合后，通过整合素介导的内吞作用被内化，然后主动运输至细胞核内，其DNA可在细胞核内游离表达（Hirata和Russell，2000）。尽管腺病毒载体适用于多种细胞类型的瞬时转染，但对于一些难以转染的细胞系（如非分裂细胞）及稳定表达应用，则首选慢病毒载体。腺病毒的包装容量为7-8 kb。逆转录病毒是一种正链RNA病毒，能稳定地将其基因组整合至宿主细胞染色体内。当病毒包被上具有广泛嗜性的包膜（如水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G），形成假型病毒，则这些病毒几乎可以进入所有类型的哺乳动物细胞。但是，大部分转录病毒依靠细胞分裂过程中核膜的破裂感染细胞，因此需要细胞复制方可完成转

107、导。逆转录病毒的其他缺点包括可能引起插入突变并激活潜伏性疾病。与腺病毒类似，逆转录病毒可以携带约8 kb的外源性基因。慢病毒是逆转录病毒家族的一个亚群；因此，它们可以整合至宿主细胞基因组中，实现稳定、长期的表达（Anson，2004）。与其他逆转录病毒不同，慢病毒采用活化的细胞核输送途径转导非分裂、终末分化的细胞群体（如神经元和造血细胞），是一种用途更广泛的工具。腺相关病毒能够转导广泛的分裂和非分裂细胞类型，但需要同时感染一种辅助病毒（如腺病毒或疱疹病毒），才能在包装细胞中产生重组病毒粒子。这会导致难以获得不含辅助病毒的高质量病毒储液。此外，腺相关病毒的最大包装容量仅为4.9 kb。另一方面，

108、腺相关病毒在大多数细胞类型中表现出低免疫原性，并且它们能够整合至人类染色体的特定区域内，从而避了免插入突变。常见病毒载体68|细胞培养基础知识仅供教学使用。病毒系统大小DNA插入片段大小最高效价（颗粒/mL）感染表达缺点腺病毒36 kb(dsDNA)8 kb1 x 1013分裂和非分裂细胞瞬时引起强烈的抗病毒免疫应答逆转录病毒711 kb(ssRNA)8 kb1 x 109分裂细胞稳定插入突变潜能慢病毒8 kb(ssRNA)9 kb1 x 109分裂和非分裂细胞稳定插入突变潜能腺相关病毒8.5 kb(ssDNA)5 kb1 x 1011分裂和非分裂细胞稳定；位点特异性整合需要辅助病毒帮助复制；

109、难以生成纯的病毒储液杆状病毒80180 kb(dsDNA)No known upper limit2 x 108分裂和非分裂细胞瞬时或稳定哺乳动物宿主有限牛痘病毒190 kb(dsDNA)25 kb3 x 109分裂细胞瞬时潜在的细胞病变效应单纯疱疹病毒150 kb(dsDNA)3040 kb1 x 109分裂和非分裂细胞瞬时在潜伏性感染过程中无基因表达适用于蛋白质过表达的其他病毒载体系统包括基于杆状病毒、牛痘病毒和单纯疱疹病毒载体。尽管杆状病毒一般感染昆虫细胞，重组杆状病毒可以作为基因转移载体，在各种哺乳动物细胞中用于重组蛋白的瞬时表达。此外，杆状病毒载体中还包含显性选择标记物，从而可以提取

110、出稳定表达重组基因的细胞系（Condreay等人，1999）。利用牛痘病毒载体可以将较大的DNA片段导入各种哺乳动物细胞中。但是，感染牛痘病毒的细胞会在一或两天内死亡，因此该系统仅限用于瞬时蛋白生产。单纯疱疹病毒是一类可用于神经元感染的双链DNA病毒。病毒介导的基因转移（续）细胞培养基础知识|69仅供教学使用。Neon转染系统是由Thermo Fisher Scientifc提供的第二代台式电穿孔设备，它以电子移液器吸头作为电穿孔室，可对包括原代和永生化造血细胞、干细胞和原代细胞在内的各种哺乳动物细胞进行高效转染。电穿孔室的设计可以使电流均匀分布于细胞内，在电穿孔室中维持稳定的pH值，减少离子

111、形成和热量产生，相比传统的比色皿型电穿孔系统具有更高的细胞活性和转染效率。Neon转染系统可将核酸、蛋白和siRNA导入包括原代细胞和干细胞在内的各种哺乳动物细胞，具有很高的细胞活性。该转染方法适合各种细胞培养类型（60 mm培养皿、6孔、48孔和24孔培养板），使用10或100 L体积的样品，每次反应最少只需1104个或最多5106个细胞。Neon转染系统所用转染试剂盒适合包括原代细胞和干细胞在内的各种哺乳动物细胞，因此无需针对各细胞类型确定最佳缓冲液。此外，Neon转染设备已预先编制了一套24孔优化实验方案，可根据核酸/siRNA和细胞类型优化反应条件，也可根据具体细胞类型编制实验方案，储

112、存在Neon转染设备数据库中，最多可储存50套方案。此外，还可从 264.7细胞小鼠MPC-11细胞小鼠Ramos细胞小鼠RBL-2H3细胞小鼠BW5147（T200-A）5.2细胞小鼠M1细胞小鼠EL4细胞小鼠P815细胞结缔组织人HOS细胞人MH7A细胞人BJ细胞人HT-1080细胞人U-2 OS细胞人IMR-90细胞人Saos-2细胞人类新生儿皮肤成纤维细胞Gibco人WI-38细胞小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）小鼠NIH/3T3细胞小鼠PA317细胞小鼠L-929细胞小鼠3T3-L1细胞猴COS-7细胞猴Vero细胞马胚胎皮肤成纤维细胞（NBL-6）上皮细胞人T24细胞人ChangX-3

113、1细胞人HEK293细胞人ARPE-19细胞人COLO 201细胞人HCT 116细胞人253J细胞人HT-29细胞人HCT15细胞人RKO细胞人SW480细胞人WiDr细胞人293A细胞人J82细胞人RT4细胞人Hep G2细胞人Hep3B细胞人BT-20细胞人乳腺上皮细胞Gibco人SK-HEP-1细胞人SNU-387细胞人HCC1937细胞人Hs-578T细胞人MCF7细胞人MDA-MB-231细胞人SK-BR-3细胞人T-47D细胞人SK-OV-3细胞人DU 145细胞人MCF-ADR细胞人LNCaP细胞人A549细胞人PANC-1细胞人BxPC-3细胞人NCI-H23细胞人PC-3细

114、胞人TSU-Pr1细胞人BEAS-2B细胞人NCI-H69细胞人HN3细胞人G-361细胞人ARO细胞人HeLa细胞（ATCC）人FRO细胞人Calu-3细胞人MEWO细胞人NPA细胞人A-431细胞人C-33细胞小鼠P19细胞大鼠GH3细胞大鼠NRK细胞大鼠PC-12细胞大鼠H-4-II-E细胞中国仓鼠CHO-K1细胞中国仓鼠CHO DG44细胞仓鼠BHK-21细胞犬MDCK细胞内皮细胞人内皮细胞Gibco人HUVEC细胞小鼠b-END.3细胞肌肉细胞人主动脉平滑肌细胞Gibco小鼠C2C12细胞大鼠L6细胞大鼠心肌细胞神经/胶质细胞人T98G细胞人U-87 MG细胞人SK-N-MC细胞人S

115、H-SY5Y细胞小鼠GT1-1细胞小鼠GT1-7细胞小鼠胶质细胞大鼠皮层星形胶质细胞Gibco大鼠原代皮层神经细胞Gibco大鼠星形细胞大鼠胶质前体细胞Gibco大鼠原代海马神经细胞Gibco大鼠HiB5细胞大鼠C6胶质细胞大鼠SCN2.2细胞大鼠F-11细胞分泌细胞人SW-13细胞人SV40 MES 13细胞干细胞人间充质干细胞（hMSC）人BGO1V胚胎干细胞人H9胚胎干细胞人神经干细胞Gibco人脂肪干细胞（ADSC）小鼠胚胎干细胞大鼠神经干细胞Gibco*有关使用本表所列细胞类型的优化Neon转染实验方案的信息，请访问 Geneticin（G418硫酸盐）、Zeocin、潮霉素B、嘌呤

116、霉素和杀稻瘟菌素是最常用于稳定细胞转染的选择性抗生素。这些抗生素提供了满足您研究需要的独特解决方案，如双重选择和快速、稳定的细胞系建立。Geneticin选择性抗生素Geneticin试剂又称为G418硫酸盐，常用于筛选哺乳动物、植物或酵母细胞。Geneticin试剂纯度更高，意味着其使用浓度较其他G418产品低15-30%；因此，存活的克隆集落生长更快速，而且细胞更健康。Zeocin选择性抗生素Zeocin试剂对哺乳动物细胞系、酵母、昆虫细胞和细菌有效。She ble基因可使细胞获得对Zeocin试剂的抗性，防止表达蛋白质的细胞中结合Zeocin试剂并出现细胞DNA剪切。用于筛选时的浓度范围

117、为50至2,000 g/mL（一般为300 g/mL），具体浓度取决于细胞类型。用于真核细胞的选择性抗生素72|细胞培养基础知识仅供教学使用。潮霉素B选择性抗生素潮霉素B是一种氨基糖苷类抗生素，可干扰80S核糖体的易位并导致误译，从而抑制蛋白质的合成。由于其作用方式与Geneticin或Zeocin试剂不同，因此潮霉素B可用于双重筛选实验。大肠杆菌潮霉素抗性基因（hyg或hph）会使细胞产生潮霉素B抗性。筛选浓度范围为100至1,000 g/mL（一般为200 g/mL），使用时应依据各细胞系进行优化。二盐酸嘌呤霉素选择性抗生素Gibco嘌呤霉素盐酸盐是一种源于白黑链霉菌的氨基核苷类抗生素，是

118、原核细胞和真核细胞的翻译抑制剂。链霉菌中的嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶基因（pac）使细胞获得抗性。嘌呤霉素作用迅速，低抗生素浓度时即可导致细胞迅速死亡，在不到一周的时间里即可生成稳定的抗嘌呤霉素细胞系。其浓度为2-5 g/mL时对哺乳动物贴壁细胞敏感，而浓度低至0.5-2 g/mL时即可对悬浮细胞有效。杀稻瘟菌素S盐酸盐选择性抗生素杀稻瘟菌素是从灰色产色链霉素中提取的核苷类抗生素，它是一种强效翻译抑制剂，对原核细胞和真核细胞均有效。土曲霉的bsd基因产物会使细胞产生抗性。该试剂通常在浓度达50 g/mL时对大肠杆菌菌株有效，而浓度低至2-10 g/mL时即可对哺乳动物细胞有效。对杀稻瘟菌素敏感

119、的细胞会迅速死亡，只需较低的抗生素浓度，在不到一周的时间里即可获得稳定的抗杀稻瘟菌素哺乳动物细胞系。稳定转染子的选择（续）细胞培养基础知识|73仅供教学使用。报告基因是其产物可用于转染后分析的基因，可用作转染细胞筛选的标记物，用于基因表达调控研究，或用作转染效率标准化的对照品。理想的报告基因应是研究使用的细胞中不存在的基因，或可以与该基因的天然形式轻松区分，检测方便，且具有较广的线性检测范围。另外，报告基因的存在不应影响转染细胞的正常生理学和基本健康。报告基因呈组成型表达，或者可被外来干预（如在-半乳糖苷酶系统中导入IPTG）诱导。一般在转染1-3天后进行报告基因分析，但分析的最佳时间应根据经

120、验确定。选择标记物可保护生物体不受选择性试剂影响，这些选择性试剂通常会杀死生物体或干扰其生长，而用于转染子筛选的报告基因则可以轻松鉴别出包含报告基因的细胞。上述用途的报告基因一般可在其自身启动子的调控下表达，与导入的目的基因无关，因此，即便目的基因只在特定条件下表达或者其所在的组织难以获取，亦可利用报告基因来筛选成功转染的细胞。报告基因还可用作转染的对照。例如，通过比较所有实验中使用的报告基因的表达水平，可以对不同实验的转染效率进行标准化。报告基因分析对于基因表达调控研究具有不可估量的价值，包括顺式作用因子（基因调控元件）和反式作用因子（转录因子或外源性调控因子）。此外，报告基因系统可以使通路

121、特异性、组织特异性或发育调控基因启动子用作特异性事件或过程的生物标记物。在这些分析中，可检测的报告基因可用作待研究基因编码区的替代物。报告基因重组体包含一个或多个待分析的基因调控元件、报告基因序列和功能mRNA转录所需的序列。将报告基因重组体导入细胞后，可以通过直接分析报告蛋白质的酶活性监测报告基因的表达水平。转染分析基因调控分析报告基因分析74|细胞培养基础知识仅供教学使用。可诱导可鉴别特性的常用报告基因通常包括荧光和化学发光蛋白。表达绿色荧光蛋白（GFP）的细胞可在紫外光照射下发出绿色荧光。需要采用专门的显微镜观察单个细胞。此外还有黄色和红色荧光蛋白可供选择，一次可检测多个基因。它常用于检

122、测基因表达。荧光素酶用作实验试剂时通常是指北美萤火虫荧光素酶，尽管还有来源于其他种属的萤火虫的重组荧光素酶产品可供选择。荧光素酶可以催化其底物（一般为荧光素），根据荧光素酶基因的不同，产生黄绿光或蓝光荧光。由于荧光素酶的生物发光无需激发光，几乎不会出现自发荧光，可以实现无本底荧光。GUS分析（使用-葡萄糖苷酸酶）是一种出色的单细胞检测方法，无需复杂设备即可将细胞染成蓝色。但缺点是细胞在此过程中会被杀死。它常用于植物科学。蓝-白斑菌落筛选可用于细菌和真核细胞。细菌lacZ基因编码-半乳糖苷酶。加入含有特定半乳糖苷（如X-gal）的培养基后，表达该基因的细胞将X-gal转变为蓝色，肉眼即可观察到。

123、常用的报告基因报告基因分析（续）细胞培养基础知识|75仅供教学使用。RNA干扰（RNAi）是一种功能强大的细胞生物学基础研究工具，可在各种细胞类型中通过抑制基因表达研究蛋白质功能。以前该技术仅限于部分实验室使用，如今，RNAi已成为基因功能研究的基本工具。RNAi是蛋白质抑制研究、表型分析、功能恢复、通路分析、体内抑制和药物靶点发现的主要工具。RNAi核糖核酸干扰（由Fire和Mello等人，1998年首次使用）。siRNAsiRNA，即短干扰RNA，长度为21-25 bp，3 末端带有两个突出的核苷酸，是长双链RNA（dsRNA）被RNAi通路中的Dicer酶切割成的双链RNA分子。将合成的

124、siRNA导入哺乳动物细胞内可产生RNA干扰。另外，siRNA也可来源于内源性前体。shRNA短发夹RNA，又称为短干扰发夹。可以采用基于载体的shRNA将siRNA导入细胞，实现稳定的基因沉默。采用Pol 型强启动子控制靶序列的转录，形成长度可变的发夹和环，然后通过细胞siRNA机制进行处理。shRNA一旦进入细胞，可以通过RNAi下调具有互补序列的基因的表达。miR RNAi表达microRNA的载体，用于RNAi。miRNA是19-23 nt的单链RNA，其单链前体转录本含有碱基不完全配对的发卡结构。miRNA在沉默复合物中的功能与RISC类似（参见下文）。Chemically modi

125、fied siRNA具有化学修饰的siRNA分子。RISCRNA诱导沉默复合物（RISC）是一种由蛋白质和siRNA组成的核酸酶复合物，可以靶向剪切与RISC复合物中与siRNA互补的内源性mRNA。常用RNAi术语表RNAi和非编码RNA研究76|细胞培养基础知识仅供教学使用。RNAi和非编码RNA研究（续）脱靶效应导入siRNA或D-siRNA库后，出现一个或多个非特异性靶基因沉默的现象。这种效应既可能来自于siRNA反义链，也可能来自正义链。有两类小RNA分子在RNAi中起作用。第一类是人工合成的短片段干扰RNA（siRNA），它可以靶定并切割目标基因的mRNA，有效地抑制特定基因表达。

126、第二类是microRNA（miRNA）分子，是天然存在的单链RNA，长度为19-22个核苷酸，它通过结合靶mRNA的3 非翻译区（UTR），抑制其翻译，从而实现基因沉默（Ambros，2004）。有关RNAi的更多信息，请访问 SelectsiRNAStealth RNAi siRNAshRNA expression哺乳动物细胞中的siRNA靶mRNA破坏细胞信息miRNA expressionDicer processing of long dsRNA(pool of 2123 nt siRNAs)Target cleavageRISC loading siRNA unwindingTarg

127、et recognitionDicer Synthetic molecules for RNAiVector-based RNAiIn vitrosynthesized RNAi图5.8.哺乳动物细胞中的RNAi方法。化学合成RNAi基于载体的RNAishRNA表达miRNA表达体外合成的RNAiDicer酶处理长片段dsRNARISC的组装siRNA解螺旋靶点识别（21-23 nt siRNA库）靶点切割 细胞培养基础知识|77仅供教学使用。RNA聚合酶II和III转录含有miRNA的基因，在RNA酶III Drosha的作用下生成较长的初级转录本miRNA（pri-miRNA），获得长度为

128、70至90 bp的发夹结构（pre-miRNA）。Pre-miRNA发夹结构被转移至细胞质，在核酸内切酶Dicer的作用下进一步加工为短双链miRNA，长度为19-22个核苷酸。miRNA双链可被RNA诱导沉默复合物（RISC）识别，RISC是一种多蛋白核酸酶，且两条链其中一条（即引导链）可以帮助该蛋白复合物识别其同源mRNA转录本。RISC-miRNA复合物通常与靶mRNA的3 UTR作用，且作用区域的序列同源性低，它们可以抑制蛋白质合成，但其机制尚未完全清楚（图5.9）。植物miRNA可以通过精确或几乎精确的互补碱基配对与靶mRNA序列结合，直接剪切并降解mRNA（Rhoades等人，20

129、02；Chen，2005）。与RNA干扰（RNAi）机制类似，靶mRNA上磷酸二酯键的剪切发生在第10和第11个碱基之间（Elbashir等人，2001）。但迄今为止研究的几乎所有动物的miRNA都未与其mRNA靶点完美互补，并可以在抑制蛋白质合成的同时维持mRNA靶点的稳定性（Ambros，2004）。研究表明，转录本可能受多个miRNA的调控，单个miRNA可能靶向多个转录本。研究显示，多达三分之一的人类基因可能由miRNA调控（Lim等人，2003）。尽管已经在各种生物体中发现了数以百计的miRNA，但关于其细胞功能仍知之甚少。miRNA的一些独特物理属性，包括体积小、缺乏多聚腺苷酸尾巴

130、及易与序列同源性低的mRNA靶点结合，这增加了miRNA的研究难度。有关miRNA分析的更多信息，请访问 miRNA(pre-miRNA)Dicer核孔Xpo-5miRNA解螺旋Nucleus细胞质miRNA与mRNA具有100%同源性，引起靶mRNA剪切RISCPol II 和 Pol IIImRNA 转录miRNA 基因m7GpppmiRNA与同源性低的3 UTR结合，抑制翻译RISC3 UTR图5.9.miRNA的产生与功能。在RNA聚合酶II和III作用下生成microRNA转录本，经RNA酶III Drosha（细胞核）和Dicer（细胞质）处理后，获得19-22个核苷酸的miRNA

131、双链。其中一条链参与形成RISC复合物，调控蛋白质表达。78|细胞培养基础知识仅供教学使用。siRNA或miRNA均可调控RNAi（RNA干扰）过程。两种方法均由Dicer酶在细胞内完成，并形成RISC复合物（RNA诱导沉默复合物）。但是，两者之间存在些许差异。siRNA是外源性双链RNA，可以通过化学合成后直接转染至细胞内，或者将表达短发夹RNA（shRNA）的载体导入细胞，在细胞内生成，其中短发夹RNA是siRNA的前体。而miRNA为单链，来源于RNA上内含子中的内源性非编码RNA。但shRNA形成功能siRNA与基因组编码的miRNA，都可以通过调节mRNA稳定性、翻译和染色质结构进行

132、细胞基因表达调控（Hutvagner和Zamore，2002）。siRNA和miRNA之间的另一差异在于，siRNA一般可与动物体内的mRNA靶点实现完全匹配且特异性地结合，而miRNA无法实现完全匹配，从而抑制许多非靶mRNA序列的翻译。但在植物中，miRNA更易形成完全匹配，诱导mRNA剪切，而不仅仅是抑制翻译。siRNA和miRNA均可通过RNA诱导的转录沉默（RITS），在表观遗传学方面发挥作用。同样地，鉴于它们在基因表达调控方面的作用，二者也都是重要的治疗靶点。选择RNAi方法RNAi和非编码RNA研究（续）siRNAmiRNA来源天然存在于植物和低等动物中，但是否天然存在于哺乳动物

133、体内目前尚不清楚天然存在于植物和动物中结构双链单链长度21-22 nt19-25 nt与靶mRNA的互补性100%完全匹配；因此，siRNA可以抑制特定的基因，几乎无脱靶现象不精确；因此，单个miRNA可靶向多达数百种mRNA机制调控与其有相同序列的基因表达由生成miRNA的基因表达，但调控的基因（mRNA）并非只有表达miRNA的基因作用剪切mRNA抑制mRNA翻译功能在无抗体或细胞免疫系统的动植物中发挥基因沉默保护机制基因（mRNA）调节因子（抑制剂）用途siRNA作为基因沉默的工具，几乎每个分子生物学实验室都会用到。一些siRNA还会用于临床治疗试验可用作药物靶点或药物制剂。另外，miR

134、NA的表达水平可用作潜在的诊断和生物标志物工具*本表改编自Mack，2007。细胞培养基础知识|79仅供教学使用。6.转染方法本节提供了有关质粒DNA、寡核苷酸和RNA转染细胞，体外和体内转染培养液制备以及转染细胞选择的有用信息和一般指导原则。请注意，转染实验的基本原理大致相同，但不同种类的细胞，转染条件存在巨大差异。因此，我们建议您应熟悉自己使用的细胞系及适合它的转染方法，实验中严格遵守每个产品的操作说明。转染效率的影响因素转染是否成功受许多因素的影响：转染方法的选择、细胞系的健康和活性、细胞传代次数、汇合度、所用核酸的质量和数量以及培养基中是否含有血清，这些都会影响转染实验的结果。虽然可以

135、通过优化转染条件，实现高转染效率，但必须注意的是，无论使用何种转染方法，都不可避免地会引起部分细胞死亡。转染实验中细胞类型的选择可能看似简单，但也是常被忽略的关键因素。由于不同细胞类型对给定的转染试剂或方法反应各异，因此选择合适的细胞类型及实验设计，是取得最优结果的必要条件。使用实验室已经建立好的连续细胞系更易操作，但并非是体内模拟的最佳选择，因为它们在传代中会存在多种遗传改变。但是，如果转染实验是为了大规模生产重组蛋白，则细胞系是否代表体内环境就并不重要，只要细胞系能够表达足量正确折叠和翻译后修饰的重组蛋白即可。例如，将目的载体瞬时转染Expi293表达培养基中悬浮培养的Expi293F细胞

136、，研究人员可得到1 g/L以上经正确折叠的糖基化重组蛋白。另一方面，由于原代培养更能模拟天然组织，因此，也常用于转染。但是，它们的生长潜力和寿命有限，且难以培养。使用原代培养时，必须维持同源性较高的细胞群体（例如，应富集神经培养物中的神经元，抑制胶质细胞的生长），并尽快使用细胞。细胞类型80|细胞培养基础知识仅供教学使用。转染效率的影响因素（续）此外，在设计转染实验时，还应考虑细胞类型的生物学特性。例如，一些启动子在不同细胞类型中的功能不同，部分细胞类型不适用于特定的转染技术。Transfection efciency in cancer cell line panelCell lineLip

137、ofectamine 3000Lipofectamine 2000100806040200Transfection efciency(%)Hx-578TSK-MEL-284T1SW480NCI-H23PANC-1Saos-2RDBT-549L6SK-OV-3DU-145HCC1937MDA-MB-468SW620NCI-H460Caki-1图6.1.不同细胞系的转染效率差异。采用Lipofectamine 2000试剂和Lipofectamine 3000试剂将表达GFP的质粒转染至17种细胞系中，按照各试剂的推荐实验方案，在24孔板中进行转染，每孔质粒用量为0.5 g。转染48小时后分析GF

138、P表达。重复检测3次，数据点显示平均转染效率标准差。转染前的细胞活性和整体的健康状态是影响转染结果的重要因素。一般而言，转染之前，应至少有90%的细胞为活细胞，且传代复苏时间应足够。我们强烈建议在转染前至少24小时传代细胞，以确保细胞能够恢复，并在转染时处于最佳生理学状态。实验室中永生化细胞系的细胞培养会随时间的变化而改变，这会导致转染细胞的行为出现变化。过度传代可能会对转染效率以及细胞群体的转基因表达水平产生不利影响。我们一般推荐使用复苏后传代次数低于30次的细胞。复苏新鲜的冻存细胞，建立低传代数培养物用于转染实验，可以提高转染后细胞的活性。为获得最佳的可重复性，可以将低传代数的细胞分装冻存

139、，在需要时复苏。复苏新细胞后，可传代3或4次。由于污染会极大地改变转染结果，应定期对细胞培养物和培养基进行生物污染检测（参见“生物污染”，第15页），被污染的培养物和培养基不得用于转染。如果细胞已被污染或细胞健康受到影响，则应弃去细胞，重新接种未污染的冻存细胞。细胞健康与活性细胞系癌症细胞系检测板中的转染效率转染效率（%）细胞培养基础知识|81仅供教学使用。为获得最佳的转染效果，应遵循常规传代操作，每周传代一次或两次，待细胞几乎完全汇合后再继续传代。不要使细胞维持在汇合状态超过24小时。细胞转染的最佳密度取决于细胞类型、应用和转染技术，应根据转染细胞系的不同，确定最佳密度。在不同的实验中保持标

140、准的接种方案可以确保转染时细胞能够达到最佳汇合度。采用阳离子脂质介导的转染，转染时贴壁细胞达到70-90%汇合，悬浮细胞达到5105到2106个细胞/mL，可以获得最佳结果。确保在细胞转染时未达到完全汇合或处于静止期，因为分裂状态的细胞相比静止状态的细胞更容易摄取外源性核酸。细胞密度过高会引起接触抑制，导致核酸摄取不佳或转染基因表达下降。但是，细胞数量太少会使细胞间缺乏接触，从而导致细胞生长不佳。在这种情况下，增加培养细胞的数量可以提高转染效率。同样，正处于分裂期的细胞系可以更高效地转导病毒载体。在非分裂细胞中转导病毒载体时，需要增加MOI（感染复数）以获得最佳的转导效率并提高重组蛋白的表达水

141、平。不同的细胞或细胞类型对培养基、血清和添加剂有着极其特定的要求，根据细胞类型和转染方法选择最适合的培养基是转染实验的关键，这类信息通常可通过发表的文献以及提供细胞的机构或者细胞库获得。如果无法找到关于您的细胞该选择何种培养基的信息，则必须根据经验确定。必须使用新鲜的培养基，尤其是当其中有些组分不稳定，因为当培养基缺少重要组分和必需添加剂会影响细胞生长。有关细胞培养基的信息，请参阅第32页的“推荐用于普通细胞系的培养基”，或访问我们的网站（ 细胞培养基础知识|83仅供教学使用。质粒DNA是最常用的转染载体。质粒DNA载体的拓扑结构（线性或超螺旋）和大小会影响转染效率。采用超螺旋质粒DNA进行瞬

142、时转染可以获得最高的效率。在稳定转染中，细胞对线性DNA的摄取水平低于超螺旋DNA，但它将DNA整合至宿主基因组中的效果最佳。尽管其他大分子（如寡核苷酸、RNA、siRNA和蛋白质）也可以转染至细胞中，但在使用其他大分子时，需要对质粒DNA的转染条件进行优化。将核酸导入细胞的方法有很多种，包括各种生物学、化学和物理方法。但是，并非所有方法都适用于所有细胞类型和实验应用，它们在转染效率、细胞毒性、对正常生理学的影响、基因表达水平等方面存在明显差异。所以应根据您的细胞类型和实验要求选择理想的方法，并且该方法应具有高转染效率、低细胞毒性、对正常生理的影响最小、易于使用和可重复。有关各种转染方法的概述

143、和比较，请参阅“基因输送技术”，第54页。转染分子的类型转染方法84|细胞培养基础知识仅供教学使用。转染方法的选择（非病毒）选择转染方法时，应考虑您想要输送的载体（DNA、RNA或蛋白质）以及要转染的细胞类型。使用下表选择Thermo Fisher Scientifc提供的各种阳离子脂质体转染试剂和Neon转染系统。有关各转染方法的更多信息，以及针对各细胞系的优化转染实验方案，请访问 3000试剂 Lipofectamine 2000试剂 Lipofectamine RNAiMAX试剂 Lipofectamine CRISPRMAX试剂 Lipofectamine MessengerMAX试剂

144、 Invivofectamine 3.0试剂 N/AN/A体内Neon电穿孔 图例符号解释符号解释符号解释质粒DNA，用于蛋白质、shRNA和miRNA表达mRNA，用于蛋白质表达非编码RNA，用于RNAi基因表达抑制共转染，用于RNAi载体和siRNA共转染CRISPR-Cas9，用于蛋白质输送 细胞培养基础知识|85仅供教学使用。原代细胞是直接从组织中分离出来并在适当条件下培养增殖的细胞。因此，它们的形态和生理学特性更接近体内状态。但是，它们通常比连续细胞系更难培养和转染。第一次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。来自原代培养的细胞系寿命有限（即：有限细胞系），随着细胞的传代，生长能力最

145、强的细胞会占据优势，最终导致细胞群体在基因型和表型上达到一定程度的均一性，并且它们的表型会处于原代细胞和连续细胞系之间。这些细胞较原代细胞更易操作，尤其是在生成稳定转染的克隆时。原代细胞与有限培养转染方法载体神经元细胞干细胞血细胞其他Lipofectamine 3000试剂 Lipofectamine 2000试剂 Lipofectamine RNAiMAX试剂 Lipofectamine CRISPRMAX试剂 Lipofectamine MessengerMAX试剂 Invivofectamine 3.0试剂 N/AN/A体内Neon电穿孔 图例符号解释符号解释符号解释质粒DNA，用于蛋白

146、质、shRNA和miRNA表达mRNA，用于蛋白质表达非编码RNA，用于RNAi基因表达抑制共转染，用于RNAi载体和siRNA共转染CRISPR-Cas9，用于蛋白质输送86|细胞培养基础知识仅供教学使用。病毒DNA输送系统的选择目前有多种可选的病毒输送系统，能满足您的特殊需求。我们提供各种病毒载体系统，可以将核酸转染入哺乳动物和昆虫细胞，用于蛋白质表达和RNAi研究。Invitrogen ViraPower 表达系统使用复制缺陷型病毒颗粒，以确保安全且高效地导入表达载体，用于在各种哺乳动物细胞中的组成型或诱导型高表达。适用于ViraPower系统的载体有很多，它们提供了各种克隆方法（Inv

147、itrogen TOPO或Gateway克隆，或GeneArt遗传组装）和启动子选择（组成型或诱导型），让您可以根据细胞系或动物模型进行实验优化。Invitrogen ViraPower 慢病毒表达试剂盒可在分裂和非分裂细胞（例如干细胞、原代神经元细胞）中稳定表达蛋白质，是长期基因表达分析和功能分析研究的理想选择。Invitrogen ViraPower HiPerform慢病毒表达试剂盒通过在病毒载体中引入旱獭转录后调控元件（WPRE）和HIV-1整合酶基因的中央聚嘌呤区（cPPT）序列，改进了现有慢病毒系统，分别提升了基因表达和慢病毒整合至宿主基因组中的效率。试剂盒有两种类型：高准确度滴度

148、试剂盒，可精确控制每个细胞的拷贝数；及快速滴定试剂盒，适用于高通量筛选研究。Invitrogen ViraPower HiPerform T-REx Gateway载体试剂盒将Invitrogen ViraPower HiPerform和T-REx慢病毒技术与Gateway克隆技术相结合，可促进目的基因在分裂或非分裂哺乳动物细胞中基于慢病毒、可调控的高表达。该系统包括一种对照质粒以及两种基于pLenti的表达载体（一种用于诱导表达目的基因，另一种用于表达Tet阻遏物）。Invitrogen ViraPower腺病毒Gateway表达试剂盒可在含巨细胞病毒（CMV）或其他选择启动子的分裂和非分裂

149、的哺乳动物细胞中进行高水平瞬时表达的理想选择。Invitrogen ViraPower腺病毒系统采用Gateway技术，可以快速、简单、准确地克隆目的基因。有关ViraPower表达系统以及本文未提及的其他表达系统的更多信息，请访问 细胞培养基础知识|87仅供教学使用。质粒DNA转染指南经典的转染技术最初用来将质粒DNA导入细胞中，而质粒DNA仍然是目前最常用的转染载体。将含有重组基因和调控元件的DNA质粒转染至细胞内，可用于研究基因功能和调控、基因产物突变分析和生物化学特性、基因表达对细胞健康和周期的影响，以及适用于纯化和下游应用的蛋白质的大规模生产。载体的大小和拓扑结构（线性或超螺旋）、质

150、粒DNA的质量以及启动子的选择是影响质粒DNA转染效率的主要因素。采用高度超螺旋DNA进行瞬时转染的效率高于线性DNA，这可能是因为环状DNA较线性DNA片段不易被外切酶降解，（McLenachan等人，2007；von Groll等人，2006）。原子力显微镜分析显示，阳离子脂质体试剂会分别与环状和线性DNA形成极为不同的复合结构：环状DNA可以观察到紧密的球形或柱形结构，而线性质粒则呈珠链样结构。另外阳离子脂质体介导的环状质粒转染可能是通过内吞作用进入细胞，与线性DNA进入细胞的方式有较大的区别并且效率较高（von Groll等人，2006）。对稳定转染，线性DNA的转染效率更高，因为它更

151、易整合至宿主细胞的基因组。尽管线性DNA被细胞摄取的效率较低，但因更容易发生重组，整合至宿主染色体生成稳定转化体的可能性更高。在阳离子脂质体介导的转染中，尽管细胞摄取率相当，但较大质粒的核输送效率低于较小的质粒。使用质量或摩尔浓度相等但大小不同的载体可以观察到上述现象，说明质粒的核输送可能会受到细胞内运输速度的限制，较小的质粒可以快速通过细胞质，躲避降解作用和细胞防御机制（Lukacs等人，2000；McLenachan等人，2007）。质粒DNA的纯度和质量是转染必要的成功因素之一。使用不含苯酚、氯化钠和内毒素的最高纯度的质粒DNA可获得最佳的结果。因为污染物会致死细胞，盐会干扰脂质体复合物

152、的形成，从而降低转染效率。载体考虑因素质粒DNA的质量88|细胞培养基础知识仅供教学使用。内毒素，即脂多糖，通常是在质粒制备的裂解步骤中释放出的，并且与质粒DNA共纯化。与质粒DNA共存的内毒素会使原代细胞和其他敏感细胞的转染效率显著下降。我们推荐使用Invitrogen PureLink HiPure质粒试剂盒（Mini,Midi,Maxi,Mega和Giga）分离DNA，为转染提供最高质量的DNA。有关更多信息，请访问 mM。启动子的选择取决于宿主细胞系、需要表达的蛋白质类型和期望的表达水平。许多研究者使用强启动子CMV，因为它可以在各种细胞类型中实现最高的转录活性。另一个用于哺乳动物细胞

153、的高水平蛋白表达的强启动子是人类延伸因子-1（EF-1）。但是，将过强的启动子用于有潜在毒性的基因表达，会在质粒DNA的瞬时转染中引起一定的问题。所以对有潜在毒性的基因产物，建议使用弱启动子。毒性基因产物也是稳定转染细胞筛选问题之一。对于组成型启动子，当抗性基因的表达危害细胞健康时，表达该基因的细胞会丧失生长优势，从而无法获得稳定转染的克隆。此时，可以使用诱导型启动子控制基因表达的时序，从而实现稳转细胞的筛选。诱导型启动子一般需要在有诱导物分子（如金属离子、代谢产物或激素）的条件下才能发挥作用，但是一些诱导型启动子可以以相反的方式发挥功能，即在无特定分子存在的情况下诱导基因表达。细胞类型特异性

154、启动子也很常用，如用于昆虫细胞表达的多角体蛋白基因启动子。文献检索是确定哪种启动子最适合您的细胞系或应用的最佳工具。无论使用何种转染方法，都必须有对照，以检查细胞健康状况，确定所使用的转染方法是否有效，并鉴别插入片段是否存在问题。阴性对照（无DNA，无转染试剂）可以保证细胞生长处于最佳条件。阳性对照（使用成熟的转染方法同时进行转染）可确定所使用的转染方法是否有效。另外，还应有一对照转染不含目的基因的质粒，确定插入片段是否存在问题。基因产物和启动子对照 细胞培养基础知识|89仅供教学使用。质粒DNA转染的优化对于任何转染过程，第一步最关键的都是优化转染条件。为了使外源DNA更好的导入细胞，每种细

155、胞类型都需要找到与之匹配的转染条件，即便是极其类似的细胞类型亦存在较大的条件差异。因此，优化转染效率最重要的是根据细胞类型选择适合的转染方案。一旦选择了合适的转染方法，即可使用报告基因瞬时表达分析系统优化转染条件，即在不同条件下转染报告基因，通过分析报告基因的产物监测转染效率。本节将对磷酸钙转染、使用Neon转染系统进行的电穿孔转染和阳离子脂质体转染的优化提供以下指导建议。影响磷酸钙转染效率的主要因素是磷酸钙-DNA共沉淀中DNA的用量、细胞与共沉淀一同孵育的时间以及甘油或DMSO休克的使用和持续时间。磷酸钙转染中的总DNA用量一般为每个10 cm培养皿10-50 g，将其溶于450 L无菌水

156、和50 L 2.5 M CaCl2，但在实际质粒制备时还需根据所用的细胞和培养基具体情况具体分析。对于一些细胞系，在每个10 cm的培养皿中加入10-15 g DNA，会导致细胞过度死亡和DNA摄取率降低；而对有的细胞系，尤其是原代细胞，则需要更高浓度的DNA。所以在使用新的质粒和细胞系进行转染前，应先测试确定最佳的DNA使用浓度。细胞与DNA-磷酸钙沉淀最适孵育时间也因细胞类型不同而异。一些生长顽强的细胞类型，如HeLa、NIH/3T3和BALB/c 3T3，可以通过孵育16小时，实现高效转染，因为这种条件下会致死一些敏感性细胞。对中试实验，可采用不同DNA用量、孵育时间以及甘油或DMSO休

157、克，可了解各细胞类型是否耐受长期的磷酸钙沉淀，以及是否应使用甘油休克。在得到中试实验结果后，可更精细地调整实验参数，进行进一步优化。例如，如果按下图所示使用10%甘油使细胞休克3分钟可以提高转染效率，则可以同时对不同时间的甘油休克或使用10-20%DMSO休克进行实验。磷酸钙-DNA共沉淀法需考虑的因素90|细胞培养基础知识仅供教学使用。培养皿(10 cm)报告基因质粒(g)孵育(hr)甘油震荡(min)1562106315642016525166301675638106391563102016311251631230163图6.2.磷酸钙共沉淀法转染优化的中试实验范例。影响阳离子脂质体介导的

158、DNA转染成功与否的主要因素有：DNA用量、转染试剂与DNA的比例、脂质-DNA复合物的孵育时间以及加入复合物时的细胞密度。应根据每种细胞类型和载体组合，对上述因素进行系统性的优化，一旦确定优化条件则应在所有实验中保持不变，以保证结果的可重复性。为获得最佳结果，请遵循试剂生产商提供的实验优化方案。我们为所有转染试剂提供实验优化方案。关于更多信息，请访问 DNA最佳用量取决于转染质粒的特性（如启动子、质粒大小、复制起始点）、待转染细胞的数量、培养皿的大小和所使用的目标细胞系。在许多受测细胞类型中，相对少量的DNA可以被细胞高效摄取并表达。事实上，在一些细胞类型中进行特定的阳离子脂质体制备，较高的

159、DNA浓度会出现抑制作用。此外，如果使用编码有毒蛋白质的质粒或使用过多高表达的质粒，也会出现细胞毒性。阳离子脂质体转染需考虑的因素 细胞培养基础知识|91仅供教学使用。质粒DNA转染的优化（续）转染试剂与DNA的比例转染复合物的总电荷数取决于转染试剂与DNA的比例。其中阳离子脂质体表面带正电荷，既能与核酸的磷酸根通过静电作用形成脂质体-DNA复合物，也能被表面带负电荷的细胞膜所吸附。转染试剂与DNA的最佳比例与细胞类型密切相关。实验初始阶段，可在质粒DNA浓度保持不变的条件下，改变转染试剂的用量（如1:1、3:1和5:1的体积质量比）。另外，也可以保持固定的比例，改变质粒的用量。孵育时间细胞与

160、转染复合物的最佳孵育时间取决于所用的细胞系和转染试剂。一般而言，转染效率随脂质体试剂-DNA复合物孵育时间的延长而提高，但孵育时间过长会引起毒性作用，所以需要在一定时间的孵育后离心或使用新鲜培养基稀释，最大程度地减小细胞毒性的影响。不过，升级后的转染试剂（如Lipofectamine 3000试剂）对细胞的作用更温和，转染后无需去除复合物或进行稀释（有关更多信息，请访问 3000转染试剂的实验方案时间步骤第0天1 接种细胞至70-90%汇合度时转染第1天2 经稀释的Lipofectamine 3000 涡旋振荡2-3秒使用Opti-MEM培养基稀释Lipofectamine 3000试剂3 经

161、稀释的DNA使用Opti-MEM培养基稀释DNA，制备DNA预混液，然后添加P3000试剂充分混匀4 在每管已稀释Lipofectamine 3000试剂中加入稀释的DNA（1:1比例）5 孵育6 向细胞中添加DNA-脂质复合物第2-4天7 显示并分析已转染细胞 细胞培养基础知识|93仅供教学使用。电穿孔法主要取决于三个电参数的组合：脉冲电压、脉冲宽度和脉冲数量。或许是由于电转不属于化学方法，它受DNA浓度的影响较小；但需要的细胞和DNA量是磷酸钙转染的近5倍。一般而言，每107个细胞转1-5 g DNA即可，此时DNA用量和细胞摄取量呈良好的线性关系。优化电穿孔参数的目的是找到可以使细胞保持

162、40-80%存活率的脉冲。脉冲宽度由电源的电容决定，其变化范围取决于产生脉冲的电源电子元件。如果发现细胞死亡过多，可下调电容，缩短脉冲宽度。将细胞置于冰上操作通常可以提高细胞存活率，从而提高效率，尤其是在功率较高引起发热的情况下（Potter等人，1984）。但是，也有一些细胞系在室温下以低电压/高电容进行电穿孔，可以获得更高的转染效率（Chu等人，1991）。对Neon转染系统，它已预先设定了18孔和24孔的优化实验方案，可以在数天内对多种贴壁和悬浮细胞系的电参数进行优化。另外，也可通过参考有关Neon转染系统对特定细胞系的已有实验数据，具体请登录在 3自动细胞计数仪、血球计数器或台盼蓝计数

163、）检测培养皿中的活细胞数。4.绘制活细胞数与抗生素浓度图，建立杀死曲线，确定杀死未转染细胞所需的最适选择性抗生素浓度。开始前杀死曲线稳定转染子的筛选 细胞培养基础知识|95仅供教学使用。稳定转染子的筛选1.采用合适的方法转染细胞。如果是在单独的载体中加入选择标记物，则使用含有目的基因的质粒与含有选择标记物的质粒的摩尔比为5:1至10:1。注:请使用含选择标记物但不含目的基因的载体进行实验对照。转染后，如果含对照质粒的细胞形成集落，但含目的基因质粒的细胞未形成集落，则表示目的基因可能对细胞致死。另外，如果转染失败或培养物被污染，则应重新转染。2.转染四十八小时后，以不同稀释比例的（如1:100、

164、1:500）将细胞传代至选择性培养基中。由于处于汇合、非生长状态的细胞对抗生素具有抗性，因此要实现高效筛选，应使用处于半汇合状态的细胞。可在软琼脂或96孔板中筛选悬浮细胞进行单细胞克隆。3.随后的两周，每3至4天（或根据需要）更换新鲜的选择性培养基。注:因为高密度的悬浮细胞会耗尽重要的可溶性生长因子，降低细胞活性和系统效率，因此需要频繁更换培养基。4.在第二周，监测存活的“岛状”细胞。根据细胞类型的不同，具有抗药性的克隆可在2-5周内出现。转染阴性对照质粒的细胞应在3-9天后死亡。5.使用克隆环或无菌牙签分离较大的健康集落（500-1,000个细胞），继续在选择性培养基中培养（有关悬浮培养物的

165、克隆分离，请参见（Freshney,1993）。6.将抗性集落中的单细胞转接至96孔板内，确认它们可以生长出抗性集落。注意请确保每个孔只含一个细胞。筛选过程96|细胞培养基础知识仅供教学使用。RNAi策略的选择常用的两种RNAi导入方法是脂质体转染和病毒转导。确定使用哪种方式取决于所研究的细胞类型，以及希望瞬时还是稳定抑制。最常见的是使用Invitrogen Silencer Select siRNA或Stealth RNAi siRNA进行瞬时转染，它使用的是阳离子脂质体试剂，因为该试剂适用于各种常用的细胞系（请参见第97页的非载体siRNA技术）。对于难以用脂质体转染的细胞类型，则通常使用

166、病毒载体（参见第99页的载体介导的RNAi）。腺病毒载体在许多细胞类型的瞬时转染效果都很好。而对于稳定RNAi表达或对难转染的细胞系（如非分裂细胞）进行转导，慢病毒载体则更为适合。确定最佳RNAi转染条件的另一种方法是使用我们的转染优化服务，即在病毒载体和非病毒载体输送试剂方面拥有丰富的专业知识，可以测试各种输送参数。siRNA和基于载体的RNAi均可高效地获得功能性失活表型。一般而言，大多数研究人员会选择siRNA，因为siRNA可以快速上手，除了基本的细胞培养技术以外，无需特殊准备。但是，研究人员选择siRNA或基于载体的RNAi的原因也有很多种。研究人员一般都希望获得尽可能高的转染效率。

167、RNAi应用尤其如此，因为未转染成功的细胞将继续表达靶向抑制的基因，从而提高本底表达水平。对于许多疾病模型而言，原代细胞是最理想的细胞类型。但是，采用商品化的阳离子脂质体转染试剂无法实现高效转染，所以此时应选择含可表达RNAi序列载体的病毒转染法。该方法适用于难转染的细胞、原代细胞和非分裂细胞。另外，病毒转染法还可用于建立具有诱导型RNAi表达的稳定细胞系，或者组织特异性启动子表达RNAi序列。siRNA与基于载体的RNAi 方法比较细胞类型瞬时表达稳定表达（7天）生长迅速的贴壁细胞（A549，HeLa）Silencer Select siRNA或Stealth RNAi siRNA的脂质体转

168、染RNAi载体的脂质体转染或腺病毒导入RNAi载体的脂质体转染或慢病毒导入生长迅速的悬浮细胞（THP-1）Silencer Select siRNA或Stealth RNAi siRNA的脂质体转染或电转RNAi载体的脂质体转染或腺病毒导入RNAi载体的脂质体转染或电转或慢病毒导入原代细胞siRNA或RNAi载体的脂质体转染或电转慢病毒导入非分裂细胞 细胞培养基础知识|97仅供教学使用。RNAi策略的选择（续）对于瞬时抑制实验，采用化学合成的非载体方法进行RNAi转染相比基于载体的方法具有明显的优势。因为非载体实验一般更易设计和操作，可以获得更高水平的瞬时抑制。此外，目前RNAi设计的改进可增

169、加实现高水平抑制的可能性，并且只需检测少数RNAi分子。因此，使用合成RNA双链是最常用的RNAi实验方法。合成siRNA用于哺乳动物细胞基因抑制的传统RNAi方法通常使用由两个未经修饰的21-mer寡核苷酸退火形成的RNA双链得到短/小干扰RNA（siRNA）。Invitrogen Silencer Select siRNA和Stealth RNAi siRNA采用专利的化学修饰改善传统双链，可获得更好的RNAi结果。如需了解更多信息，请登录 Select siRNA适用于RefSeq数据库中所有人、小鼠和大鼠基因靶点。这种siRNA采用了高效且经广泛测试的算法设计，可实现效价和特异性的最大

170、化。每条siRNA均遵照最严格的质量标准合成，并提供全部序列信息。Stealth RNA siRNA分子是经化学修饰、长度为25-mer的平末端双链，它可以被RNA诱导的沉默复合物（RISC）所识别，从而介导对靶基因的抑制。其专利的化学修饰使Stealth RNAi siRNA能够克服体内实验的诸多障碍，确保其在体内实验中的高效稳定。Silencer Select siRNA是最适合体外研究的siRNA，有各种形式可供选择，包括预制产品和定制文库，简化了筛选实验。它们与其他siRNA（修饰和未修饰）相比，效价高100倍，可获得更高比例的“中靶”表型。miRNA模拟物和抑制剂miRNA功能分析的

171、方法与蛋白编码基因所使用的相似。用miRNA模拟物转染培养的细胞，有助于鉴定功能获得性表型；用Invitrogen miRNA抑制剂进行下调或抑制实验，能用来鉴定功能丧失性表型。上调和下调的组合使用可用于鉴定被特定miRNA调控的基因和细胞的过程。非载体siRNA技术98|细胞培养基础知识仅供教学使用。Invitrogen Pre-miR miRNA前体是化学修饰的双链小分子RNA，与siRNA类似但不相同，可用于模拟内源性成熟miRNA。Invitrogen mirVana miRNA模拟物是化学修饰的双链小分子RNA，可以模拟内源性miRNA，并能够通过上调miRNA活性实现miRNA功能

172、分析。这些分子通过专利的化学修饰灭活星号链，因此特异性较上一代产品更高。mirVana miRNA模拟物可以单独或作为文库提供。Invitrogen Anti-miR miRNA抑制剂是化学修饰的单链核酸，可用于特异性地结合并抑制内源性miRNA。Invitrogen mirVana miRNA抑制剂是化学修饰的单链小分子RNA，可用于特异性地结合并抑制内源性miRNA分子，并能够通过下调miRNA活性实现对miRNA的功能分析。在最低的miRNA抑制剂浓度下（存在miRNA模拟物），可以提供最高的体外抑制效价。mirVana miRNA抑制剂可单独或作为文库提供。由于这些合成分子的体积较小，

173、较载体更易转染，能在与siRNA类似的条件下导入细胞。与miRNA表达载体不同，它们能用于剂量反应研究。注:Pre-miR miRNA前体并非发夹结构，不可与pre-miRNA混淆。Pre-miR前体mirVana miRNA模拟物Anti-miR抑制剂mirVana miRNA抑制剂功能模拟内源性miRNA模拟内源性miRNA抑制内源性miRNA抑制内源性miRNA实验目的功能获得（体内或体外）功能获得（体内或体外）功能丧失（体内或体外）功能丧失（体内或体外）序列数据库100%覆盖miRBase v15*100%覆盖miRBase v19*100%覆盖miRBase v15*100%覆盖mi

174、RBase v19*模型系统体外体外和体内体外体外和体内包括的属种人人、小鼠、大鼠（其他种属：使用定制工具）人人、小鼠、大鼠（其他种属：使用定制工具）定制设计工具GeneAssist miRNA搜索及设计工具GeneAssist miRNA搜索及设计工具GeneAssist miRNA搜索及设计工具GeneAssist miRNA搜索及设计工具miRNA文库预先设计或定制文库预先设计或定制文库预先设计或定制文库预先设计或定制文库备注说明全新设计，脱靶效应最小化新一代化学试剂可实现最低的脱靶效应通过化学修饰提供高效率新一代化学试剂可实现最高的效率*1,090种不同的人源序列。*2,019种不同的

175、人源序列。细胞培养基础知识|99仅供教学使用。RNAi策略的选择（续）采用siRNA转染试剂可以将siRNA轻松导入细胞内。siRNA分子进入哺乳动物细胞后参与合成RNA诱导沉默复合物（RISC）。在siRNA反义链的引导下，RISC可以降解目的mRNA，抑制其翻译，然后通过分析检测RNAi活性。一般同时设置对照，对RNAi结果进行比较。RNAi的成功取决于导入适量的siRNA，达到最好的预期结果，但要做到精确十分困难。siRNA脱靶效应会导致细胞死亡，并影响实验数据分析。研究人员一直致力于寻找更好的siRNA设计和导入方法。对于采用脂质体难转染的细胞类型（如难转细胞、原代细胞和非分裂细胞），

176、通常可使用含RNAi表达框的病毒载体。另外，病毒导入也可用于建立具有诱导型RNAi表达的稳定细胞系，或者组织特异性启动子表达RNAi序列。腺病毒载体适用于多种细胞类型的瞬时转染，但对于分裂和非分裂细胞的稳定转染，则首选慢病毒。基于载体的RNAi转染方法载体转染效率转染效率说明Lipofectamine RNAiMAX试剂 极佳极佳最高效地siRNA/miRNA转染试剂可实现高效的基因抑制Lipofectamine 3000试剂 极佳极佳最高效的通用型试剂，适用于各种细胞类型，包括难转染的细胞Lipofectamine 2000试剂 高高高效的通用型试剂，适用于各种常见细胞类型Neon电穿孔法

177、最佳良好适合所有细胞系图例符号解释符号解释符号解释符号解释DNA，用于蛋白质、shRNA和miRNA表达mRNA，用于蛋白质表达非编码RNA，用于RNAi基因表达抑制共转染，用于RNAi载体和siRNA共转染siRNA转染100|细胞培养基础知识仅供教学使用。Invitrogen BLOCK-iT腺病毒RNAi 表达系统通过构建并导入复制缺陷型腺病毒，在绝大多数分裂或非分裂哺乳动物细胞类型和动物模型中瞬时表达shRNA，用于RNAi分析。它的主要优点是Gateway重组技术可简化腺病毒载体的克隆和构建，避免了其他腺病毒载体所需的繁琐耗时的处理、筛选和多次转化。Invitrogen BLOCK-

178、iT慢病毒RNAi表达系统可以构建并导入经过改造的shRNA和miRNA至分裂和非分裂哺乳动物细胞中，包括原代和难以转染的细胞。该系统可不进行筛选用于瞬时RNAi分析，或者使用适当的抗生素筛选，用于生成稳定的细胞系，进行长期基因抑制研究。Invitrogen BLOCK-iT慢病毒Pol II miR RNAi表达系统将Invitrogen BLOCK-iT Pol II miR RNAi和ViraPower慢病毒技术相结合，可以构建并稳定转染经过改造的miRNA至非分裂细胞、原代细胞和难以转染的细胞中。表达载体中的Pol II启动子可实现多个miRNA的顺反子共表达，用单个载体对多个靶点进行

179、抑制，该过程适用于多种通路组分或剪接变异体的抑制，或者利用基因抑制构建合成表型。BLOCK-iT慢病毒Pol II miR RNAi表达系统（带EmGFP）可提供BLOCK-iT慢病毒Pol II miR RNAi表达系统具备所有组件和优点，另外还可以利用共表达顺反子EmGFP轻松实现表达追踪。ViraPower HiPerform版本的表达载体含有mRNA稳定元件（WPRE）和细胞核导入序列（cPPT），可以获得5倍的病毒滴度。Invitrogen BLOCK-iT可诱导H1慢病毒RNAi系统是一套完整的慢病毒系统，可在几乎任何细胞类型中用于长期诱导型或组成型shRNA的表达。利用四环素操纵

180、子（TetO2）序列调控长期诱导型，可对包括必需基因在内的各种基因在不同时间的研究以及功能丧失实验；它提供了一种极佳的控制系统，可用于检测基因功能恢复过程中表型的变化。病毒系统何时使用腺病毒RNAi导入 高水平的瞬时shRNA表达 高效导入至各种类型的人源细胞 动物模型研究慢病毒RNAi导入 各种细胞系中的RNAi稳定表达，特别是非分裂细胞，包括干细胞、淋巴细胞和神经元 诱导型或组成型shRNA或miR RNAi表达 动物模型研究 细胞培养基础知识|101仅供教学使用。RNA转染指导原则RNA转染是经典转染技术的一个分支，可以将RNA导入至细胞内。RNA转染的目的类似于质粒转染，即将mRNA导

181、入细胞内，表达编码蛋白，并研究基因功能和调控。siRNA适用于RNAi研究，检测基因抑制的效果。两种方法的主要区别在于，RNA仅适用于瞬时转染。下图显示了siRNA设计和合成完成后的RNAi实验流程。进行RNAi实验时，确保已准备好下列材料：转染/电转试剂和实验方案 评估抑制及其他RNAi效果的分析方法 阳性和阴性对照siRNA 两条或两条以上靶向目的基因的siRNARNAi工作流程Find and order siRNAs at: siRNA-induced knockdown to:Validate the siRNA Monitor transfection effciencyObser

182、ve/measure phenotypic changePlate cells and transfect siRNAs12Prep RNA34410100515CycleControl siRNASurviving siRNA202530354010.10.01020406080100NEK4-1NEK4-2NEK4-3TGFBR2-1TGFBR2-2TGFBR2-3STK6-1STK6-2STK6-3RPS6KA4-1RPS6KA4-2RPS6KA4-3MAP2K1-1MAP2K1-2MAP2K1-3MAP2K4-1MAP2K4-2MAP2K4-3WEE1-1WEE1-2WEE1-3PK4

183、28-1PK428-2PK428-3STK12-1STK12-2STK12-3PCNA gold%RNA remaining30t5335Rn图6.4.siRNA设计和合成完成后的RNAi实验流程如需查找和订购siRNA，请访问： 监测转染效率观察/检测表型变化剩余RNA%对照siRNA存活的siRNA102|细胞培养基础知识仅供教学使用。RNA寡核苷酸在操作过程中极易受到外源性核糖核酸酶的作用而降解。处理RNA时请佩戴手套 制备用于转染的RNA时应使用不含RNA酶的试剂、试管和移液器吸头 应使用70%乙醇或其他RNA酶去污剂溶液（例如Invitrogen RNaseZap RNase 去污溶

184、液）擦拭工作区哺乳动物细胞中的siRNA转染效率因细胞类型和所用的转染试剂的不同而异。这意味着必须根据经验确定转染时的最佳浓度。影响siRNA转染效率的主要因素包括：转染试剂类型和用量 孔中的细胞数 RNA或siRNA的类型 RNA或siRNA的浓度每个实验必须包括阳性对照。阳性对照应能够在研究分析细胞时具有检测的可重复性。如果您观察到该对照在预定阈值水平之上/下具有最大效应，则表示同一天的其他实验的测量结果均可靠。请注意，必须根据经验确定每种分析方法和对照的阈值。针对特定RNA或siRNA的响应度与其转染效率直接相关。为评估转染效率，我们推荐在每个实验中使用Invitrogen BLOCK-

185、iT荧光寡核苷酸。在转染实验中使用BLOCK-iT荧光寡核苷酸，您可以利用荧光显微镜和标准FITC滤光片组轻松评估寡聚体的吸收和转染效率。80%的细胞吸收荧光寡聚体即代表高转染效率。RNA处理转染效率阳性对照 细胞培养基础知识|103仅供教学使用。RNA转染指导原则（续）阴性对照与阳性对照同样重要，有助于获得可信结果。转染时应包括至少一条等摩尔量的阴性对照，用于比对靶RNA或siRNA处理和对照处理细胞的效果。上述重要的对照数据可用作靶点抑制评估实验的基线。未转染或仅含细胞的阴性对照同样十分重要。通过比较未转染细胞和转染含非靶向RNA细胞中看家基因的表达，可获得转染本身对细胞活性影响的有效信息

186、。阴性对照对照类型建议用途推荐产品转染对照利用荧光计算并监测转染效率 BLOCK-iT Alexa Fluor红色荧光对照 BLOCK-iT荧光寡核苷酸阴性对照利用非特异性或错序对照检测抑制水平及背景 Silencer Select阴性对照siRNA Stealth RNAi siRNA阴性对照 Silencer阴性对照siRNA阳性对照利用已知可以获得高抑制水平的RNAi试剂检测导入效果，并优化实验条件 Silencer Select GAPDH阳性对照siRNA Stealth RNAi siRNA阳性对照 Silencer阳性对照siRNA未转染的对照检测正常基因表达水平和基因型针对同一

187、靶点的多条RNAi序列用于验证表型变化，控制脱靶效应，生成可供发表的实验结果RNAi滴定采用最低的效率水平，避免改变细胞的正常过程回补实验关闭可诱导的RNAi或导入表达靶mRNA但不影响RNAi序列的质粒采用诱导型启动子的BLOCK-iT Pol II miR RNAi或BLOCK-iT shRNA载体（分别为CMV/TO和H1/TO）当用户想要同时导入siRNA和用于蛋白表达的质粒至细胞时，可使用共转染。该蛋白可以是检测系统的一部分，或者在更多情况下可用作报告基因（荧光素酶、GFP、-内酰胺酶）。某些情况下，用户可能想要表达突变蛋白及siRNA，利用siRNA阻断某个通路，使突变蛋白过表达。

188、当使用脂质体转染试剂时，质粒可能会降低共转染（质粒和siRNA）的转染效率，因此转染优化十分重要。如果脂质体过多会引起非预期的非特异性细胞死亡；或者如果转染条件不合适，会导致较低的基因抑制或蛋白表达。共转染104|细胞培养基础知识仅供教学使用。siRNA的质量会对RNAi实验产生重要影响。siRNA须不含合成试剂残留，如乙醇、盐和蛋白质。此外，长度超过30 bp的dsRNA污染物可以通过激活非特异性的干扰素反应改变基因表达，引起细胞毒性（Stark等人，1998）。因此，我们推荐使用标准纯度超过80%全长siRNA。siRNA的储存 将siRNA置于-20C或-80C保存，但切勿储存于无霜冰箱

189、内。我们的数据显示，50次以下的反复冻融不会对100 M的siRNA溶液产生不利影响（采用质谱和分析HPLC评估）。但是，我们建议将重悬于不含RNA酶的水或缓冲液中的siRNA进行分装保存，以避免出现污染。siRNA的核酸酶抗性尽管退火的双链siRNA对核酸酶的抗性远高于单链RNA，但在RNAi整个实验过程中中都应采用严格的无RNA酶技术。检查siRNA是否降解如果您怀疑制备好的siRNA可能被降解，可以取约2.5 g进行15-20%非变性丙烯酰胺凝胶电泳，检查siRNA的完整性。另外，可采用溴化乙锭染色法显示RNA，确认其是否为预期大小和强度。siRNA应呈现紧凑的条带；条带模糊表示有降解现

190、象。siRNA的最佳用量及其引起基因沉默的能力在某种程度上受靶基因产物性质的影响，包括：mRNA位置、稳定性、丰度以及靶蛋白的稳定性和丰度。尽管许多siRNA实验的细胞转染量仍为100 nM siRNA，但公开发表的研究结果显示，转染较低浓度的siRNA可降低siRNA引起的脱靶效应（Jackson等人，2003；Semizarov等人，2003）。脂质体介导的反向转染一般只需10 nM siRNA即可（范围为1-30 nM）。采用电穿孔进行siRNA转染时，siRNA用量引起的效果差异不明显，但一般1 g/50 L的细胞（1.5M）与siRNA的使用比例在0.5-2.5 g/50 L细胞或0

191、.75-3.75 M即可。值得注意的是，siRNA过多会引起脱靶或细胞毒性效应，siRNA过少则可能会降低靶基因表达水平。由于其中涉及的变量过多，因此需要针对每种细胞系优化siRNA用量。此外，非靶向的siRNA阴性对照的用量应与实验组siRNA相同。siRNA质量siRNA的用量 细胞培养基础知识|105仅供教学使用。转染试剂的体积是一个重要的优化参数，体积过少会限制转染，过多则会引起毒性。最终转染效率受与siRNA结合的转染试剂量的影响。在优化时，可以在较宽的浓度范围内对转染试剂进行滴定，选择浓度最低但仍能提供良好的基因抑制效果的浓度。另外，对每种细胞系都应该分别优化确定最优体积。在传统的

192、预接种转染实验中，细胞密度十分重要，但采用反向转染导入siRNA时，细胞密度的影响较低，所以一般无需优化。但是，如果使用的细胞过多，而不相应增加siRNA用量，则样本中的siRNA浓度可能会过低，无法实现高效的基因沉默。相反当细胞密度过低时，则培养物会变得不稳定，且这种不稳定性会因孔而异，因为多孔板中各孔间的培养条件（如pH、温度）会存在差异。尽管大多数转染试剂都尽可能地减少细胞毒性，但细胞暴露在过多转染试剂中或暴露时间过长均会危害细胞培养物的整体健康。敏感细胞暴露在转染试剂中几个小时后即开始死亡。如果转染会引起过多细胞死亡，则应在8-24小时后去除转染混合物，补充新鲜培养基。转染试剂和siR

193、NA复合物的形成应在减血清或无血清培养基中进行，以避免血清组分对转染的影响。但一旦当复合物形成，一些转染试剂则允许使用含有血清的正常培养基进行转染（遵循生产商的说明）。转染后无需加入培养基或更换培养基，但某些情况下，更换培养基可以获得更好的结果（甚至在使用血清相容性试剂时）。在使用特定的试剂之前，应确定其血清相容性。一些转染试剂在转染过程中需要使用无血清培养基，在与转染复合物完成初始孵育后再更换为完全培养基。转染试剂的体积细胞密度 细胞在转染试剂/siRNA复合物中的暴露转染过程中血清的存在RNA转染指导原则（续）106|细胞培养基础知识仅供教学使用。1.针对每个基因设计并检测二至四条siRN

194、A序列。切勿自行设计siRNA，可登录 细胞培养基础知识|107仅供教学使用。7.使用阴性对照siRNA鉴别非特异性的影响（参见第104页）。可以通过打乱大多数活性siRNA的核苷酸序列设计阴性对照。但应进行同源性比对，确保阴性对照序列与待研究的生物体基因组无同源性。8.使用带标记的siRNA优化实验方案。荧光标记的siRNA可用于siRNA稳定性和转染效率分析。标记siRNA还可用于研究siRNA亚细胞定位，以及在双标记实验中（利用标记抗体）观察成功转染siRNA的细胞并将转染与靶蛋白下调相关联。RNA转染指导原则（续）siRNA转染优化使转染效率最大化和细胞毒性最小化是实现最佳基因沉默的关

195、键。与siRNA诱导的基因抑制和细胞活性之间的平衡类似，siRNA转染与下游表型分析条件之间也存在平衡关系。需要根据不同的下游分析应用重新优化siRNA转染条件。通过鉴别下列因素，可在各种细胞类型中获得最佳转染效率（按重要性排序）：1.转染试剂的选择 2.转染试剂的体积 3.siRNA用量4.转染时的细胞密度5.细胞暴露在转染试剂/siRNA复合物中的时长6.转染方法：传统转染（预接种细胞）或反向转染（在细胞贴壁时转染）7.是否存在血清确定好某种细胞类型的最佳基因沉默条件后，应在实验中保持该条件不变。siRNA转染效率的影响因素108|细胞培养基础知识仅供教学使用。故障排除附录下表列出了在细胞

196、培养实验中可能遇到的一些疑难问题以及解决方案。需要注意的是，这个表格只包含细胞培养中最常遇到的问题，而且仅提供指导原则作为解答。为了提高评估结果的体验，我们建议您阅读产品随附的手册和信息表，以及有关实验工作的文献和书籍。问题原因解决方案细胞储存液解冻后没有活细胞细胞储存不正确获取新的细胞储存液并储存在液氮中。将细胞保存在液氮中，然后等待解冻。自制冷冻细胞储存液中没有活细胞按照供应商推荐的密度对细胞进行冷冻。使用低传代细胞制作冷冻细胞储存液。严格按照供应商推荐的程序冷冻细胞。请注意，本手册中推荐的冷冻程序为一般程序，仅供参考。获取新的细胞储存液。细胞解冻不正确严格按照供应商推荐的程序解冻细胞。请

197、注意，手册中推荐的解冻程序为一般程序，仅供参考。确保快速解冻冷冻细胞，但接种前需要使用预热的生长培养基缓慢稀释。培养基解冻不正确使用供应商推荐的培养基。确保培养基已预热。细胞稀释过度按照供应商推荐的密度接种解冻后的细胞，优化回收率。细胞处理过程不够轻柔大多数细胞在冷冻和解冻时均受到外力作用。移出细胞时，请勿涡旋、敲打培养瓶，或高速离心细胞（昆虫细胞培养除外）。冷冻培养基中使用的甘油在光照条件下储存（如适用）如果储存在光照条件下，甘油会转化为丙烯醛，对细胞有毒。获取新的细胞储备液。细胞生长缓慢生长培养基不正确使用供应商推荐的培养基，使用前预热。生长培养基中的血清质量不良使用不同批次的血清。细胞传

198、代次数过多使用健康、传代次数少的细胞。细胞生长超出所需汇合度处于对数期的哺乳动物细胞，在达到融合度前便进行传代。培养物被支原体污染丢弃细胞、培养基和试剂。获取新的细胞储备液，并与新制备的培养基和试剂一起使用。细胞培养基础知识|109仅供教学使用。细胞培养和转染产物我们为您的细胞培养实验提供各种原代培养物和现成的细胞系，以及试剂、培养基、血清和生长因子。下表列出一部分Thermo Fisher Scientifc可为您提供的常见细胞系和其他细胞培养产品。有关我们产品的更多信息，请访问 GnTI细胞1小瓶A39240Expi293F诱导细胞1小瓶A39241Expi293F诱导GnTI细胞1小瓶A

199、39242FreeStyle 293-F细胞1 mLR79007293-F细胞，SFM适应（7.5106个细胞）1.5 mL11625-019293-H细胞，SFM适应（7.5106个细胞）1.5 mL11631-017293FT细胞系3 106个细胞R700-07293A细胞系3 106个细胞R705-07GripTite 293 MSR细胞系1套R795-07CHO DG44细胞（cGMP保存）和培养基试剂盒1套A11000-01昆虫细胞系ExpiSf9细胞1小瓶A35243Sf9细胞（SFM适应）（1.5107个细胞）1.5 mL11496-015Sf21细胞（SFM适应）（1.5107

200、个细胞）1.5 mL11497-013Mimic Sf9昆虫细胞（1107个细胞）1 mL12552-014在Sf-900 III SFM中适应的Sf9细胞（1.5107个细胞）1小瓶12659-017在Sf-900 III SFM中适应的Sf21细胞（1.5107个细胞）1小瓶12682-019Sf9冷冻细胞（Graces培养基）（1107个细胞）1 mLB825-01Sf21冷冻细胞（Graces培养基）（1107个细胞）1 mLB821-01High Five细胞，在Express Five SFM中驯化（3106个细胞）1 mLB855-02110|细胞培养基础知识仅供教学使用。Gib

201、co细胞培养基可支持多种哺乳动物细胞系的生长。Thermo Fisher Scientifc提供的所有细胞培养基产品均经过污染检测，并保证满足质量、安全性、一致性和监管合规性要求。除了下文列出的培养基外，我们还提供多种无血清和专用培养基，用于原代细胞、已建立的细胞系和干细胞，以及用于病毒生产、蛋白质表达、干细胞分化和细胞遗传学研究。有关细胞培养基的更多信息和完整列表，请访问 DMEM500 mLA4192101BenchStable DMEM/F-12500 mLA4192001BenchStable MEM500 mLA4192201BenchStable RPMI 1640500 mLA4

202、192301DMEM（1X），液体（高葡萄糖，不含谷氨酰胺）10 500 mL35053-036DMEM（1X），液体（低葡萄糖，不含谷氨酰胺）500 mL11054-020DMEM（1X），液体（高葡萄糖，含GlutaMAX-I）10 500 mL10564-029DMEM（1X），液体（低葡萄糖，含GlutaMAX-I）10 500 mL10567-022Advanced DMEM（1X），液体（高葡萄糖，不含谷氨酰胺）10 500 mL12491-023DMEM/F-12，液体，1:1（含GlutaMAX-I）10 500 mL10565-042DMEM/F-12，液体，1:1（含L-谷

203、氨酰胺）10 500 mL11320-082Advanced DMEM/F-12，液体，1:1（不含谷氨酰胺）10 500 mL12634-028最低必需培养基（MEM）（1X），液体（不含谷氨酰胺）10 500 mL11090-099最低必需培养基（MEM）（1X），液体（含GlutaMAX-I）10 500 mL41090-101Advanced MEM（最低必需培养基）（1X），液体（不含谷氨酰胺）10 500 mL12492-021RPMI培养基1640（1X），液体（不含谷氨酰胺）1,000 mL21870-084RPMI培养基1640（1X），液体（含GlutaMAX-I）10 5

204、00 mL61870-127Advanced RPMI培养基1640（1X），液体（不含谷氨酰胺）10 500 mL12633-020杂交瘤-SFM1 L12045076Expi293表达培养基1 LA1435101293 SFM II，液体1,000 mL11686-029CD 293培养基，液体1,000 mL11913-019FreeStyle 293表达培养基1,000 mL12338-018ExpiCHO表达培养基1 LA2910001CD CHO培养基（1X），液体1,000 mL10743-029CHO-S-SFM II1,000 mL12052-098Freestyle CHO

205、表达培养基1,000 mL12651-014CD OptiCHO培养基（1X），液体1,000 mL12681-011Recovery细胞培养冻存培养基，液体50 mL12648-010Synth-a-Freeze冻存培养基50 mLR-005-50*表中列出的大多数培养基含有Gibco L-谷氨酰胺、GlutaMAX-I添加剂。但也有一部分培养基不含谷氨酰胺。有的培养基含有酚红，有的则不含。这些培养基也可以粉末和液体的形式提供。*还可提供其他规格和包装尺寸产品。细胞培养基础知识|111仅供教学使用。细胞培养和转染产物（续）异源蛋白质的表达通常选用昆虫细胞培养。对于大规模生产或基础研究而言，昆

206、虫细胞能够表达大量具有复杂翻译后修饰的蛋白质。Thermo Fisher Scientifc提供的Gibco昆虫培养基可促进蛋白质最大程度生长和最高产量。获取更多信息，请访问 CD培养基1 LA3767802Graces昆虫细胞培养基，无添加剂（1X），液体500 mL11595-030Graces昆虫细胞培养基，含添加剂（1X），液体500 mL11605-094SF-900 II SFM（1X），液体500 mL10902-096SF-900 III SFM（1X），液体500 mL12658-019Schneider果蝇培养基（1X），液体10 500 mL11720-067IPL-41

207、昆虫培养基（1X），液体1,000 mL11405-081Express Five SFM（1X），液体1,000 mL10486-025*本表中列出的大多数培养基均以粉末和液体的形式提供。*还可提供其他规格和包装尺寸产品。我们提供多种用于细胞培养的Gibco动物血清，包括牛血清和非牛血清，其中胎牛血清（FBS）用途最广。下表列出了Thermo Fisher Scientifc提供的部分血清产品。请访问 mLA4766801特级胎牛血清胎牛血清，经过认证，One Shot形式，美国10 50 mLA3160402胎牛血清，经过认证，美国500 mL16000044特殊用途胎牛血清活性炭处理的胎

208、牛血清(Charcoal Stripped FBS)500 mL12676029超低胎牛血清(Ultra-Low FBS)500 mL16250078透析胎牛血清(Dialyzed FBS)500 mL26400044胚胎干细胞专用的胎牛血清500 mL16141079MSC专用的胎牛血清500 mL12662029已去除外泌体的胎牛血清(Exosome-Depleted FBS)500 mLA2720801四环素调控系统专用胎牛血清(Tet-System Approved FBS)500 mLA4736401Value Plus FBS胎牛血清，经验证，One Shot形式，美国10 50

209、mLA3160502胎牛血清，经验证，美国500 mL26140079Value FBS胎牛血清，经验证，One Shot形式，USDA认可的地区10 50 mLA3160602胎牛血清，经验证c，USDA认可的地区500 mL10437028胎牛血清，经验证，One Shot形式，加拿大10 50 mLA3160702胎牛血清，经验证，加拿大500 mL12483020*为了确保供应，我们从美国、新西兰、澳大利亚和其他符合USDA进口要求的国家/地区采购FBS。所有其他血清产品的来源均采购自新西兰，但兔血清除外，因为采购自美国。*除不同规格和包装尺寸外，还提供热灭活和特殊用途胎牛血清。112

210、|细胞培养基础知识仅供教学使用。Thermo Scientifc Nunc细胞培养产品已被世界各地的实验室研究人员使用了超过60年。我们非常自豪能够提供始终如一的高质量产品，来帮助您得到最具可重现性和最可靠的研究结果。我们的产品仅使用符合美国药典VI级测试的高质量原材料制造而成。我们的大多数细胞培养产品都用来源可靠的Gibco培养基做过测试，以确保多种细胞系都能良好生长。敬请访问 EasYDish培养皿（直径35 mm高13 mm），表面经过Nunclon Delta细胞培养物处理500150460Nunc EasYDish培养皿（直径60 mm高16 mm），表面经过Nunclon Delt

211、a细胞培养物处理280150462Nunc EasYDish培养皿（直径100 mm高17 mm），表面经过Nunclon Delta细胞培养物处理150150464Nunc EasYDish培养皿（直径100 mm高21 mm），表面经过Nunclon Delta细胞培养物处理240150466Nunc EasYDish培养皿（直径150 mm高21 mm），表面经过Nunclon Delta细胞培养物处理80150468Nunc EasYFlask（培养面积25 cm2），经Nunclon Delta认证200156367Nunc EasYFlask（培养面积75 cm2），经Nunclo

212、n Delta认证100156499Nunc EasYFlask（培养面积175 cm2），经Nunclon Delta认证30159910Nunc EasYFlask（培养面积225 cm2），经Nunclon Delta认证30159934Nunc6孔细胞培养多孔皿，经Nunclon Delta认证75140675Nunc24孔细胞培养多孔皿，经Nunclon Delta认证75142475Nunc96孔细胞培养多孔皿，经Nunclon Delta认证50167008Nunc Edge 96孔细胞培养微孔板，经Nunclon Delta认证50167425Nunc Nunclon Sphe

213、ra 96孔U型底3D细胞培养微孔板8174925Nunc96孔微孔板，经Nunclon Delta认证，黑色50137101Nunc96孔微孔板，经Nunclon Delta认证，白色501361011 mL，单独包装，去除纸/塑料包装，已堵住孔1,000170353N2 mL，单独包装，去除纸/塑料包装，已堵住孔500170354N5 mL，单独包装，去除纸/塑料包装，已堵住孔200170355N10 mL，单独包装，去除纸/塑料包装，已堵住孔200170356N25 mL，单独包装，去除纸/塑料包装，已堵住孔200170357N50 mL，单独包装，去除纸/塑料包装，已堵住孔100170

214、358NNunc 15 mL锥形离心管，散装500339650Nunc 15 mL锥形离心管，架500339651Nunc 50 mL锥形离心管，散装500339652Nunc 50 mL锥形离心管，架300339653Nunc Lab-Tek培养腔室玻片，4孔96177399Nunc Lab-Tek培养腔室玻片，8孔96177402Nunc Lab-Tek腔室盖玻片，4孔96155383Nunc Lab-Tek腔室盖玻片，8孔96155411Nunc Lab-Tek II培养腔室玻片，4孔96154526Nunc Lab-Tek II培养腔室玻片，8孔96154534Nunc Lab-Tek

215、 II腔室盖玻片，4孔96155382Nunc Lab-Tek II腔室盖玻片，8孔96155409 细胞培养基础知识|113仅供教学使用。下表列出了部分Thermo Fisher Scientifc为实验室提供的细胞培养试剂。更多信息和完整列表，请访问 s磷酸盐缓冲液（D-PBS）（1X），液体1,000 mL14040-117Earle s 平衡盐溶液（EBSS）（1X），液体500 mL14155-063Hank s 平衡盐溶液（HBSS）（1X），液体1,000 mL14025-076磷酸盐缓冲液（PBS）pH值7.4（1X），液体500 mL10010-023磷酸盐缓冲液（PBS）p

216、H值7.2（1X），液体500 mL70013-032缓冲液和化学品HEPES缓冲液（1M）20 100 mL15630-130碳酸氢钠溶液，7.5%（w/v）100 mL25080-094细胞解离试剂含酚红的TrypLE Express细胞解离试剂500 mL12605-028不含酚红的TrypLE Express细胞解离试剂100 mL12604-013TrypLE Select细胞解离试剂500 mL12563-029胰蛋白酶，0.5%（10X），液体，含EDTA，不含酚红100 mL15400-054胰蛋白酶，0.25%（10X），液体，不含EDTA，含酚红500 mL15050-05

217、7胶原酶I型1 g17100-017胶原酶II型1 g17101-015分散酶5 g17105-041胰蛋白酶抑制剂，大豆1 g17075-029添加剂L-谷氨酰胺*，200 mM（100X），液体100 mL25030-081GlutaMAX-I添加剂100 mL35050-061D-葡萄糖（右旋糖）1 kg15023-021Pluronic F-68，10%（100X）100 mL24040-032MEM氨基酸溶液（50X），液体100 mL11130-051MEM非必需氨基酸溶液10 mM（100X），液体100 mL11140-050MEM丙酮酸钠溶液10 mM（100X），液体100

218、 mL11360-070MEM维生素溶液（100X），液体100 mL11120-0522-巯基乙醇（1,000X），液体50 mL21985-023CHO CD EffcientFee试剂盒1套A10241-01FoamAway 经辐照的AOF（非动物源性）消泡剂500 mLA1036902*还可提供其他规格和包装尺寸产品。*也可以液体和粉末形式提供。HBSS可以含或不含镁和钙以及酚红。细胞培养和转染产物（续）114|细胞培养基础知识仅供教学使用。抗生素用于保护细胞培养物的完整性、细胞系的选择和细胞系构建。我们提供多种抗生素、抗真菌剂和检测试剂盒。更多信息请访问 mL15240-062两性霉

219、素B抗真菌剂，液体20 mL15290-018庆大霉素试剂溶液（10 mg/mL），液体10 mL15710-064庆大霉素试剂溶液（50 mg/mL），液体10 mL15750-060庆大霉素/两性霉素溶液10 1 mLR-015-10硫酸新霉素，粉末100 g21810-031青霉素-链霉素，液体100 mL15140-122青霉素-链霉素-新霉素（PSN）抗生素混合物100 mL15640-055选择抗生素Geneticin选择抗生素，液体20 mL10131-027Geneticin选择抗生素，粉末1 g11811-023潮霉素B20 mL10687-010嘌呤霉素二盐酸盐，筛选抗生素

220、，液体10 1 mLA11138-03杀稻瘟菌素S HCl，筛选抗生素，液体20 mLA11139-02杀稻瘟菌素S HCl，粉末50 mgR210-01Zeocin选择试剂，粉末1 gR250-01污染检测试剂盒细胞培养物污染检测试剂盒-200次检测1套C7028MycoFluor支原体检测试剂盒1套M7006*还可提供其他规格和包装尺寸产品。细胞培养基础知识|115仅供教学使用。产品表达系统规格*货号Heat StablebFGF人重组蛋白大肠杆菌100 gPHG0369TPO（血小板生成素）人重组蛋白哺乳动物100 gPHC9511BMP4人重组蛋白哺乳动物100 gPHC9531BMP

221、7人重组蛋白哺乳动物1 mgPHC9543Activin A人重组蛋白哺乳动物100 gPHC9561VEGF人重组蛋白哺乳动物100 gPHC9391EPO人重组蛋白哺乳动物500 IUPHC2054RSPO1人重组蛋白稳定CHO细胞50 gA42586FGF-10人重组蛋白大肠杆菌50 gA42547IL-7人重组蛋白大肠杆菌100 gPHC0071IL-23人重组蛋白哺乳动物100 gPHC9321IL-2人重组蛋白大肠杆菌100 gPHC0021TGFB1人重组蛋白哺乳动物10 gPHG9214M-CSF人重组蛋白哺乳动物100 gPHC9501HGF人重组蛋白杆状病毒100 gPHG

222、0321EGF人重组蛋白大肠杆菌100 gPHG0311SARS-CoV-2刺突蛋白（S-RBD）（aa 319-541），His Tag重组蛋白HEK293100 gRP-87678SARS-CoV-2核衣壳蛋白（aa 1-419），His Tag重组蛋白HEK293200 gRP-87689人ACE2（aa 1-615），hFC Tag重组蛋白HEK293200 gRP-87692我们提供了一系列经过细胞培养验证的强效、纯化的生长因子、趋化因子、细胞因子以及其他蛋白质和蛋白质抑制剂。这些产品已通过Gibco培养基在活细胞生物测定中验证。更多信息和完整列表，请访问 Countess 3 FL

223、和Countess 3自动细胞计数仪具有先进的自动对焦和机器学习图形分析算法，可避免计数时可能出现的用户差异，同时为您提供快速且精确的细胞计数服务。获取更多信息，请访问 3 FL自动细胞计数仪1台A49893Countess II自动细胞计数仪1台A49891Countess细胞计数室载玻片50片C10228Countess 可重复使用玻片1台A25750Countess 可重复使用玻片支架1台AMEP4746*表中所列的产品也可能具有不同的用量和包装尺寸。我们可提供种类最齐全的阳离子脂质体转染试剂，产品性能出众，可用于DNA、siRNA、寡核苷酸和RNA导入。下表列出了Thermo Fish

224、er Scientifc提供的部分阳离子脂质体转染试剂更多信息和完整列表，请访问 3000转染试剂1.5 mLL3000015Lipofectamine 2000转染试剂1.5 mL11668019Lipofectamine 2000 CD（化学成分确定）转染试剂1mL12566014Lipofectamine RNAiMAX转染试剂1.5 mL13778150Lipofectamine CRISPRMAX试剂1.5 mLCMAX00001Lipofectamine MessengerMAX转染试剂1.5 mLLMRNA015Invivofectamine 3.0试剂1mLIVF3001Exp

225、iFectamine 293转染试剂盒11 LA14524ExpiFectamine CHO转染试剂盒11 LA29129ExpiFectamine Sf转染试剂1 mLA38915FreeStyle MAX试剂1 mL16447100Cellfectin II试剂1 mL10362100*还可提供其他规格和包装尺寸产品。细胞培养基础知识|117仅供教学使用。Neon转染系统可将核酸、蛋白质和siRNA高效输送到包括原代和永生化造血细胞、干细胞和原代细胞在内的各种哺乳动物细胞中，具有很高的细胞存活率。如需了解有关Neon转染系统和各种常用细胞类型的优化Neon染实验方案，请登录 L套装）192

226、次反应MPK10096Neon转染系统（10 L套装）192次反应MPK1096Neon转染系统移液器各1台MPP100Neon转染系统移液器架各1台MPS100Neon转染试管1套MPT100RNAi是一种特异、高效且极为成功的方法，可以在几乎所有真核生物体中进行功能缺失研究。我们开发出了两种类型的小RNA分子用于RNAi研究：短干扰RNA（siRNA）分子和microRNA（miRNA），并可提供各种产品用于体外和体内RNAi分析，包括高通量文库。选择哪种RNAi工具取决于您的实验模型、抑制所需时长和其他实验参数。此外，我们可提供种类最齐全的阳离子脂质体转染试剂，产品性能出众，可用于各种R

227、NAi试剂的导入，包括shRNA和miR RNAi载体以及各种合成分子，如siRNA、Stealth RNAi siRNA和Dicer酶切siRNAi库。我们还利用上述转染试剂针对多种常用细胞系开发了细胞特异性RNAi转染实验方案。如需了解更多信息及完整的Thermo Fisher Scientifc RNAi产品列表，请登录 DMEM/F-12500 mL12634010Geltrex不含LDEV低生长因子基底膜基质1 mLA1413201AlgiMatrix 3D培养系统，96孔板596孔板12684031经人类球状体验证合格的肝细胞(Human Spheroid-Qualifed Hep

228、atocytes)1瓶HMCPSQ定制iPSC细胞系定制 Sphera 96孔板，U形底一盒8个174925多孔板中的Nunc聚碳酸酯细胞培养小室一盒48个140620CytoVista 3D细胞培养清除/染色试剂盒1套V11325PrestoBlue HS细胞25 mLP50200CyQUANT Direct细胞增殖分析试剂盒10个微孔板C35011Countess 3 FL自动细胞计数仪1A49893EVOS M5000细胞成像系统1AMF5000Varioskan LUX多功能酶标仪1VLBLATD0*表中所列的产品也可能具有不同的规格和包装尺寸。细胞培养基础知识|119仅供教学使用。用

229、于细胞培养的实验室设备自上个世纪以来，CO2培养箱已取得很大的进展。现代尖端的细胞培养箱具有主动空气循环和污染控制功能，包括24/7 HEPA过滤，可在开门30秒后的5分钟内提供ISO 5级洁净室条件。您需要选择合适的型号，确保可以将所有传感器和温度计放置到培养箱中，以便及时监测培养细胞所处环境的参数。60多年来，美国和德国的工程师不断设计、改造并生产Thermo Scientifc CO2培养箱。Thermo Scientifc Cell Locker系统可为当今比较敏感的细胞类型（包括干细胞、原代细胞、神经元、病毒克隆等）提供更佳的稳定性、保护性和灵活性。有关Thermo Fisher S

230、cientifc细胞培养箱的更多信息和完整介绍，请访问 Scientifc生物安全柜（BSC）每一天都为您提供经认证的性能和保护性。这是普通安全柜无法做到的，主要依赖于我们的设计：Thermo Scientifc SmartFlow技术采用双直流电机，可实时地自动平衡安全柜的空气流入和下行气流速度 数字化气流验证（DAVe）可为超出规格的任何情况发出报警信号以提升保障 我们的先进技术旨在保护您和细胞的安全。如您想了解更多信息，敬请访问 Scientifc离心机及其创新转头适用于您所有的处理需求，支持从微孔板和微管到大容量实验瓶等配套实验器具，在多次离心后仍可提供出色的性能。如您想了解我们为各种

231、用途设计的离心机产品以及确保您安全分离的技术，请访问 3自动细胞计数仪和Invitrogen Qubit 4.0荧光计），我们拥有细胞分析研究所必需的工具。更多信息请访问 细胞培养基础知识|121仅供教学使用。从基因组编辑、定制培养基和细胞系工程到定制抗体生产和病毒载体服务，我们拥有专业的技术，可帮助推进您的项目进程。现在就联系我们的项目管理团队吧，了解更多信息！选择与我们合作，您在医学研究领域能获得更丰硕的研究成果！更多信息请访问 Fisher Scientifc Corporation和/或其关联公司按照Thermo Fisher Scientifc销售条款和条件（可在 V(2004)Th

232、e functions of animal microRNAs.Nature 431:350355.Anson DS(2004)The use of retroviral vectors for gene therapy-what are the risks?A review of retroviral pathogenesis and its relevance to retroviral vector-mediated gene delivery.Genet Vaccines Ther.2:9.Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,Moore DD,Seidman

233、JG,Smith JA,and Struhl K(1995)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience,NewYork.Bergelson JM,Cunningham JA,Droguett G,Kurt-Jones EA,Krithivas A,Hong JS,Horwitz MS,Crowell RL,and Finberg RW(1997)Isolation of a common receptor for Coxsackie B viruses an

234、d adenoviruses 2 and 5.Science 275:13201323.Burkholder JK,Decker J,and Yang NS(1993)Rapid transgene expression in lymphocyte and macrophage primary cultures after particle bombardment-mediated gene transfer.J Immunol Methods 165:149156.Capecchi MR(1980)High effciency transformation by direct microin

235、jection of DNA into cultured mammalian cells.Cell 22:479488.Capecchi MR(1989)Altering the genome by homologous recombination.Science 244:12881292.Chen X(2005)MicroRNA biogenesis and function in plants.FEBS Letters 579:59235931.Chesnoy S and Huang L(2000)Structure and function of lipid-DNA complexes

236、for gene delivery.Annu Rev Biophys Biomol Struct 29:27-47.Chu G and Gunderson K(1991)Separation of large DNA by a variable-angle contour-clamped homogeneous electric feld apparatus.Anal Biochem 194:439446.Condreay JP,Witherspoon SM,Clay WC,and Kost TA(1999)Transient and stable gene expression in mam

237、malian cells transduced with a recombinant baculovirus vector.Proc Natl Acad Sci U S A 96:127132.Elbashir S,Lendeckel W,and Tuschl T(2001)RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs.Genes Dev 15:188200.Fraley R,Subramani S,Berg P,and Papahadjopoulos D(1980)简介 of liposome-encapsulated S

238、V40 DNA into cells.J Biol Chem.255:1043110435.Freshney RI(2016)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications,Wiley-Blackwell,New York.Fire A,Xu S,Montgomery MK,Kostas SA,Driver SE,and Mello CC(1998)Potent and specifc genetic interference by double-stranded RNA in C

239、aenorhabditis elegans.Nature 391:806811.Glover DJ,Lipps HJ.,and Jans DA(2005)Towards safe,non-viral therapeutic gene expression in humans.Nat Rev Genet.6:299310.Graham FL and van der Eb AJ(1973)Transformation of rat cells by DNA of human adenovirus 5.Virology 54:536539.Hirata RK and Russell DW(2000)

240、Design and packaging of adeno-associated virus gene targeting vectors.J Virol 74:46124620.Hirko A,Tang F,and Hughes JA(2003)Cationic lipid vectors for plasmid DNA delivery.Curr Med Chem 10:11851193.Hutvagner G and Zamore PD(2002)A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex.Science 297:20562

241、060.Jackson AL,Bartz SR,Schelter J,Kobayashi SV,Burchard J,Mao M,Li B,Cavet G,Linsley PS.(2003)Expression profling reveals off-target gene regulation by RNAi.Nat Biotechnol 21:635637.Kim TK and Eberwine JH(2010)Mammalian cell transfection:the present and the future.Anal Bioanal Chem 397:31733178.细胞培

242、养基础知识|123仅供教学使用。Klein RM,Wolf ED,Wu R,and Sanford JC.(1992)High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.Biotechnology 24:384386.Lim LP,Glasner ME,Yekta S,Burge CB,and Bartel DP(2003)Vertebrate microRNA genes.Science 299:1540.Liu D,Ren T,and Gao X(2003)Cationic transf

243、ection lipids.Curr Med Chem 10:13071315.Lukacs GL,Haggie P,Seksek O,Lechardeur D,Freedman N,and Verkman AS(2000)Size-dependent DNA mobility in cytoplasm and nucleus.J Biol Chem 275:16251629.Mack GS(2007)MicroRNA gets down to business.Nature Biotech 25:631638.McLenachan S,Sarsero JP,and Ioannou PA(20

244、07)Flow-cytometric analysis of mouse embryonic stem cell lipofection using small and large DNA constructs.Genomics 89:708720.Nayak S and Herzog RW(2009)Progress and prospects:immune responses to viral vectors.Gene Ther 17:295304.Pfeifer A and Verma IM(2001)Gene therapy:promises and problems.Annu Rev

245、 Genomics Hum Genet 2:177211.Potter H,Weir L,and Leder P(1984)Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation.Proc Natl Acad Sci U S A 81:71617165.Rhoades MW,Reinhart BJ,Lim LP,Burge CB,Bartel B,and Bartel DP(2002)Predictio

246、n of plant microRNA targets.Cell 110:513520.Sarver N,Gruss P,Law MF,Khoury G,and Howley PM(1981)Bovine papilloma virus deoxyribonucleic acid:a novel eucaryotic cloning vector.Mol Cell Biol 1:486496.Schneckenburger H,Hendinger A,Sailer R,Strauss WS,and Schmitt M(2002)Laser-assisted optoporation of si

247、ngle cells.J Biomed Opt 7:410416.Semizarov D,Frost L,Sarthy A,Kroeger P,Halbert DN,and Fesik SW(2003)Specifcity of short interfering RNA determined through gene expression signatures.Proc Natl Acad Sci U S A 100:63476352.Shigekawa K and Dower WJ(1988)Electroporation of eukaryotes and prokaryotes:a g

248、eneral approach to the 简介 of macromolecules into cells.Biotechniques 6:742751.Shirahata Y,Ohkohchi N,Itagak H,and Satomi S(2001)J Investig Med 49:184190.Stark GR,Kerr IM,Williams BR,Silverman RH,and Schreiber RD(1998)How cells respond to interferons.Ann Rev Biochem 67:227264.Telenius H,Szeles A,Kere

249、s J,Csonka E,Praznovszky T,Imreh S,MaxwellA,Perez CF,Drayer JI,and Hadlaczky G.(1999)Stability of a functional murine satellite DNA-based artifcial chromosome across mammalian species.Chromosome Res 7:37.von Groll A,Levin Y,Barbosa MC,and Ravazzolo AP(2006)Linear DNA low effciency transfection by li

250、posome can be improved by the use of cationic lipid as charge neutralizer.Biotechnol Prog 22:12201224.Vaheri A and Pagano JS(1965)Infectious poliovirus RNA:a sensitive method of assay.Virology 27:434436.Vorburger SA and Hunt KK(2002)Adenoviral gene therapy.Oncologist 7:4659.Ye GN,Daniell H,and Sanfo

251、rd JC(1990)Optimization of delivery of foreign DNA into higher-plant chloroplasts.Plant Mol Biol 15:809819.仅供研究使用。不用于临床诊断。2020 Thermo Fisher Scientifc Inc.保留所有权利。除非另有说明，所有商标均为Thermo Fisher Scientifc及其子公司所有。Cy是GE Healthcare UK Limited的注册商标。Hoechst是Hoechst GmbH的商标。Pluronic是BASF Corporation的商标。Zeocin是I

252、nvivoGen的商标。Plan Neofuar是Carl Zeiss AG的商标。COL011985 0820如需更多的教育资源，请访问 京 南京市中央路201号南京国际广场南楼1103室 邮编 210000 电话 021-68654588*2901成 都 成都市临江西路1号锦江国际大厦1406 室邮编 610041 电话 028-65545388*5300上 海 上海市浦东新区新金桥路27号3,6,7号楼 邮编 201206电话 021-68654588*2570生命科学产品和服务业务 上海市长宁区仙霞路99号21-22楼邮编 200051 电话 021-61453628 021-6145

253、3637北 京 北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心C座7层/8层邮编 100000 电话 010-87946888广 州 广州国际生物岛寰宇三路36、38号合景星辉广场北塔204-206 单元 邮编 510000 电话 020-82401600For Research Use Only.Not for use in diagnostic procedures.2019 Thermo Fisher Scientifc Inc.All rights reserved.All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientifc and

254、its subsidiaries unless otherwise specifed.COL32290 0418赛默飞世尔科技赛默飞世尔科技在全国有共21个办事处。本资料中的信息，说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。欲了解更多信息，请扫描二维码关注我们的微信公众账号南 京 南京市中央路201号南京国际广场南楼1103室 邮编 210000 电话 021-68654588*2901武 汉 武汉市东湖高新技术开发区高新大道生物园路生物医药园C8栋5楼 邮编 430075电话 027-59744988*5401 昆 明 云南省昆明市五华区三市街6号柏联广场写字楼908单元邮编 650021 电话 0871-63118338*7001沈 阳 沈阳市沈河区惠工街10号卓越大厦3109 室 邮编 110013 电话 024-31096388*3901西 安西安市高新区科技路38号林凯国际大厦1006-08单元 邮编 710075 电话 029-84500588*3801北 京 北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心C座7层/8层邮编 100000 电话 010-87946888广 州 广州国际生物岛寰宇三路36、38号合景星辉广场北塔204-206 单元 邮编 510000 电话 020-82401600